Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.
Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.
Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo1. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia clínica limitada en las indicaciones de tumores sólidos, y cada vez es más evidente que los modelos preclínicos individuales no predicen con precisión la farmacodinámica y la eficacia clínica de un medicamento vivo 2,3. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a ampliar el estudio preclínico de los productos de células CAR-T para incluir evaluaciones paralelas en modelos de xenoinjertos y singénicos de cánceres humanos y murinos, respectivamente.
A diferencia de los modelos de xenoinjertos, en los que los tumores humanos y las células T se injertan en ratones inmunodeficientes, los modelos singénicos permiten examinar las respuestas de las células CAR-T en el contexto de un sistema inmunitario funcional. Específicamente, los ratones inmunocompetentes portadores de tumores singénicos proporcionan un sistema para estudiar la interacción entre las células T transferidas adoptivamente y los entornos específicos del contexto, incluidos los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg) que se sabe que suprimen la función de las células T en el microambiente tumoral (TME)4,5,6. Además, los modelos singénicos ofrecen una plataforma adicional para evaluar la toxicidad en el objetivo, fuera del tumor y la interacción de las células CAR-T con los factores del huésped que pueden conducir a toxicidades adicionales, incluido el síndrome de liberación de citocinas7.
A pesar de estas ventajas, el número de estudios de células CAR-T singénicas sigue siendo limitado. En particular, los modelos singénicos requieren ingeniería autóloga de células CAR-T de la misma cepa de ratón y, por lo tanto, presentan un desafío adicional debido a la falta de metodología para la transducción eficiente de células T murinas y la expansión ex vivo 2,8. Este protocolo describe los métodos para lograr una expresión estable de CAR a través de la producción de vectores retrovirales y la transducción optimizada de células T. En la Figura 1 se muestra un esquema de todo el proceso. El uso de este enfoque demuestra la transducción retroviral eficiente de células CAR-T murinas y el logro de una alta expresión de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de la ultracentrifugación. Se discuten estrategias para cambiar la especificidad antigénica de la construcción CAR, además de la coexpresión de transgenes adicionales.
Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.
Si bien este protocolo describe el …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a L. Brockmann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH 1R01EB030352 y UL1 TR001873.
0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
FACS buffer | BD | BDB554657 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |