Effektiv generering av murina chimära antigenreceptorer (CAR)-T-celler
Summary
Detta protokoll effektiviserar produktionen av retrovirala vektorer och transduktion av murina T-celler, vilket underlättar effektiv generering av CAR-T-celler från möss.
Abstract
Konstruerade cellterapier som använder chimära antigenreceptorer (CAR)-T-celler har uppnått anmärkningsvärd effektivitet hos individer med hematologiska maligniteter och genomgår för närvarande utveckling för behandling av olika solida tumörer. Hittills har den preliminära utvärderingen av nya CAR-T-cellsprodukter främst skett i xenografttumörmodeller med immundefekta möss. Detta tillvägagångssätt väljs för att underlätta framgångsrik engraftment av humana CAR-T-celler i experimentell miljö. Syngena musmodeller, där tumörer och CAR-T-celler härstammar från samma musstam, gör det dock möjligt att utvärdera nya CAR-teknologier inom ramen för ett funktionellt immunsystem och en omfattande tumörmikromiljö (TME). Protokollet som beskrivs här syftar till att effektivisera processen för CAR-T-cellgenerering hos möss genom att presentera standardiserade metoder för retroviral transduktion och ex vivo T-cellsodling. Metoderna som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas på andra CAR-konstruktioner utöver de som används i denna studie för att möjliggöra rutinmässig utvärdering av nya CAR-teknologier i immunkompetenta system.
Introduction
Adoptiva T-cellsterapier som uttrycker chimära antigenreceptorer (CAR) har revolutionerat området för cancerimmunterapi genom att utnyttja kraften i det adaptiva immunsystemet för att specifikt rikta in sig på och eliminera antigenpositiva cancerceller1. Även om framgången för CAR-T-cellterapier riktade mot B-cellsmaligniteter har validerats kliniskt, är prekliniska studier utförda i djurmodeller fortfarande avgörande för utvecklingen av nya CAR-terapier riktade mot solida tumörer. Begränsad klinisk effekt har dock hittills visats i solida tumörindikationer, och det blir alltmer uppenbart att enskilda prekliniska modeller inte exakt förutsäger farmakodynamiken och den kliniska effekten av ett levande läkemedel 2,3. Därför har forskare börjat utöka den prekliniska studien av CAR-T-cellprodukter till att omfatta parallella bedömningar i xenograft- och syngena modeller av cancer hos människa respektive murin.
Till skillnad från xenograftmodeller, där mänskliga tumörer och T-celler transplanteras in i möss med immunbrist, möjliggör syngena modeller undersökning av CAR-T-cellssvar i samband med ett funktionellt immunsystem. Specifikt tillhandahåller immunkompetenta möss som bär på syngena tumörer ett system för att studera interaktionen mellan adoptivt överförda T-celler och kontextspecifika miljöer – inklusive tumörassocierade makrofager (TAM) och regulatoriska T-celler (Tregs) som är kända för att undertrycka T-cellsfunktion i tumörmikromiljön (TME)4,5,6. Dessutom erbjuder syngena modeller ytterligare en plattform för att bedöma on-target, off-tumor toxicitet och CAR-T-cellinteraktion med värdfaktorer som kan leda till ytterligare toxicitet, inklusive cytokinfrisättningssyndrom7.
Trots dessa fördelar är antalet syngena CAR-T-cellsstudier fortfarande begränsat. Syngena modeller kräver autolog modifiering av CAR-T-celler från samma musstam och utgör därför en ytterligare utmaning på grund av bristen på metodik för effektiv murin T-cellstransduktion och ex vivo-expansion 2,8. Detta protokoll beskriver metoderna för att uppnå stabilt CAR-uttryck genom produktion av retrovirala vektorer och optimerad T-cellstransduktion. En schematisk bild av hela processen visas i figur 1. Användningen av detta tillvägagångssätt visar effektiv retroviral transduktion av murina CAR-T-celler och uppnående av högt CAR-uttryck utan behov av viruskoncentration genom ultracentrifugering. Strategier för att ändra antigenspecificiteten hos CAR-konstruktionen diskuteras utöver samuttryck av ytterligare transgener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver de steg och reagenser som krävs för retroviral transduktion av murina T-celler för att generera CAR-T-celler för in vivo-studier . Optimering av retrovirala transduktionsförhållanden ger robust CAR-uttryck utan behov av viruskoncentration genom ultracentrifugering eller ytterligare reagenser. Det finns dock flera ändringar som kan tillämpas på den här metoden.
Även om detta protokoll beskriver exempelgenerering av en GFP-specifik CAR, kan dessa met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar L. Brockmann för kritisk granskning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH 1R01EB030352 och UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
