Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi
Summary
Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.
Abstract
Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.
Introduction
Kimerik antijen reseptörlerini (CAR’lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır1. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR’ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösterilmiştir ve bireysel klinik öncesi modellerin canlı bir ilacın farmakodinamiğini ve klinik etkinliğini doğru bir şekilde tahmin etmediği giderek daha belirgin hale gelmektedir 2,3. Bu nedenle, araştırmacılar, CAR-T hücre ürünlerinin klinik öncesi çalışmasını, sırasıyla insan ve fare kanserlerinin ksenogreft ve sinjeneik modellerinde paralel değerlendirmeleri içerecek şekilde genişletmeye başladılar.
İnsan tümörlerinin ve T hücrelerinin immün yetmezliği olan farelere aşılandığı ksenogreft modellerinin aksine, sinjeneik modeller, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi bağlamında CAR-T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar. Spesifik olarak, sinjeneik tümörler taşıyan bağışıklığa yetkin fareler, tümör mikroçevresinde (TME) T hücresi fonksiyonunu baskıladığı bilinen tümörle ilişkili makrofajlar (TAM’lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg’ler) dahil olmak üzere, evlat edinilmiş olarak transfer edilen T hücreleri ile bağlama özgü ortamlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir sistem sağlar4,5,6. Ayrıca, sinjeneik modeller, sitokin salınım sendromu7 dahil olmak üzere ek toksisitelere yol açabilecek konakçı faktörlerle hedefte, tümör dışı toksisiteyi ve CAR-T hücre etkileşimini değerlendirmek için ek bir platform sunar.
Bu avantajlara rağmen, sinjeneik CAR-T hücre çalışmalarının sayısı sınırlı kalmaktadır. Özellikle, sinjeneik modeller, aynı fare suşundan CAR-T hücrelerinin otolog mühendisliğini gerektirir ve bu nedenle, verimli murin T hücresi transdüksiyonu ve ex vivo genişleme için metodoloji eksikliği nedeniyle ek bir zorluk sunar 2,8. Bu protokol, retroviral vektörlerin üretimi ve optimize edilmiş T hücresi transdüksiyonu yoluyla kararlı CAR ekspresyonu elde etme yöntemlerini özetlemektedir. Tüm sürecin bir şeması Şekil 1’de gösterilmektedir. Bu yaklaşımın kullanımı, murin CAR-T hücrelerinin verimli retroviral transdüksiyonunu ve ultrasantrifüjleme yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan yüksek CAR ekspresyonunun elde edildiğini göstermektedir. CAR yapısının antijen özgüllüğünü değiştirme stratejileri, ek transgenlerin birlikte ekspresyonuna ek olarak tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.
Bu protokol, GFP’ye özgü bir CAR’ın örnek oluşumunu aç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makalenin eleştirel incelemesi için L. Brockmann’a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH 1R01EB030352 ve UL1 TR001873 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
