Amplitude-gemoduleerde elektrodeformatie om mechanische vermoeidheid van biologische cellen te evalueren
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor mechanische vermoeidheidstests in het geval van menselijke rode bloedcellen met behulp van een amplitude-gemoduleerde elektrodeformatiebenadering. Deze algemene benadering kan worden gebruikt om de systematische veranderingen in morfologische en biomechanische kenmerken van biologische cellen in een suspensie van cyclische vervorming te meten.
Abstract
Rode bloedcellen (RBC’s) staan bekend om hun opmerkelijke vervormbaarheid. Ze ondergaan herhaaldelijk aanzienlijke vervorming bij het passeren van de microcirculatie. Verminderde vervormbaarheid wordt gezien in fysiologisch verouderde RBC’s. Bestaande technieken om de vervormbaarheid van cellen te meten kunnen niet gemakkelijk worden gebruikt voor het meten van vermoeidheid, de geleidelijke afbraak in celmembranen veroorzaakt door cyclische belastingen. We presenteren een protocol om mechanische degradatie in RBC’s van cyclische schuifspanningen te evalueren met behulp van amplitude shift keying (ASK) modulatie-gebaseerde elektrodeformatie in een microfluïdisch kanaal. Kortom, de geïnterdigiteerde elektroden in het microfluïdische kanaal worden geëxciteerd met een laagspanningswisselstroom op radiofrequenties met behulp van een signaalgenerator. RBC’s in suspensie reageren op het elektrische veld en vertonen positieve dielectroforese (DEP), die cellen naar de elektroderanden verplaatst. Cellen worden vervolgens uitgerekt als gevolg van de elektrische krachten die op de twee celhelften worden uitgeoefend, wat resulteert in uniaxiale stretching, bekend als elektrodeformatie. Het niveau van schuifspanning en de resulterende vervorming kunnen eenvoudig worden aangepast door de amplitude van de excitatiegolf te veranderen. Dit maakt kwantificeringen van niet-lineaire vervormbaarheid van RBC’s mogelijk als reactie op kleine en grote vervormingen bij hoge doorvoer. Het aanpassen van de excitatiegolf met de ASK-strategie induceert cyclische elektrodeformatie met programmeerbare laadsnelheden en frequenties. Dit biedt een handige manier voor de karakterisering van RBC-vermoeidheid. Onze ASK-gemoduleerde elektrodeformatiebenadering maakt voor het eerst een directe meting van RBC-vermoeiing door cyclische belastingen mogelijk. Het kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor algemene biomechanische tests, voor analyses van celvervormbaarheid en vermoeidheid in andere celtypen en zieke omstandigheden, en kan ook worden gecombineerd met strategieën om de micro-omgeving van cellen te beheersen, zoals zuurstofspanning en biologische en chemische signalen.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC’s) zijn de meest vervormbare cellen in het menselijk lichaam1. Hun vervormbaarheid is direct gerelateerd aan hun zuurstofdragende functionaliteit. Verminderde vervormbaarheid in RBC’s blijkt te correleren met de pathogenese van verschillende RBC-aandoeningen2. Vervormbaarheidsmetingen hebben geleid tot een beter begrip van RBC-gerelateerde ziekten3. De normale levensduur van RBC’s kan variëren van 70 tot 140 dag4. Daarom is het belangrijk om te meten hoe hun vervormbaarheid afneemt samen met het verouderingsproces, bijvoorbeeld hun vermoeidheidsgedrag als gevolg van cyclische schuifspanningen3.
Het meten van RBC-vervormbaarheid bij hoge doorvoer is een uitdaging vanwege de piconewton-schaalkrachten (~ 10-12 N) die op de individuele cellen worden toegepast. In het afgelopen decennium zijn er veel technologieën ontwikkeld om de vervormbaarheid van cellen te meten5. Vervormingsmetingen van RBC’s op eencellig niveau kunnen worden uitgevoerd met pipetaspiratie en optische pincetten, terwijl bulkanalyses worden uitgevoerd door osmotische gradiënt ektacytometrie. Ektacytometrie-analyses bieden een overvloed aan gegevens, die de mogelijkheid bieden om bloedaandoeningen te diagnosticeren 6,7. De vervormbaarheid van RBC’s kan ook worden geanalyseerd met behulp van de visco-elastische theorie door colloïde sonde atoomkrachtmicroscopie. In deze methode wordt computationele analyse toegepast om de elastische modulus van RBC’s te schatten, rekening houdend met zowel tijdsafhankelijke als steady-state responsen. De vervormbaarheid van individuele RBC’s kan worden gemeten met behulp van de single-cell microchamber array-methode. Deze methode analyseert elke cel door het membraan en cytosolische fluorescerende markers om informatie te verschaffen voor RBC-vervormbaarheid en de verdeling van cellulaire kenmerken in complexe RBC-populaties om hematologische aandoeningen te detecteren8.
Vermoeiing is een belangrijke factor in de degradatie van eigenschappen van technische materialen en biomaterialen. Vermoeiingstests maken een kwantitatieve analyse mogelijk van de integriteit en levensduur van een constructie die wordt blootgesteld aan cyclische belasting. Analyse van vermoeidheid in biologische cellen wordt al lang belemmerd door het ontbreken van een algemene, gemakkelijk toepasbare, hoge doorvoer- en kwantitatieve methode voor de implementatie van cyclische vervorming in celmembranen. Dit is mogelijk met het gebruik van elektrische signaalmodulatie en elektrodeformatietechnieken geïmplementeerd in een microfluïdische omgeving. De amplitude shift keying (ASK) techniek als digitale modulatie wordt in dit artikel toegepast via On-Off keying (OOK) modulatie. Het concept van keying verwijst naar de overdracht van digitale signalen over het kanaal, waarvoor een sinusgolfdragersignaal nodig is om te functioneren9. De AAN- en UIT-tijden kunnen gelijk worden ingesteld. Onder ON-keying komen RBC’s in een vervormde toestand terwijl ze worden blootgesteld aan een externe elektrodeformatiekracht (Fdep)10 die wordt gecreëerd door het niet-uniforme elektrische veld. Onder OFF-keying bevinden RBC’s zich in hun ontspannen toestand. We zien de vermoeidheid van RBC’s, namelijk een progressieve degradatie in hun vermogen om uit te rekken met toenemende belastingscycli. Het door vermoeidheid veroorzaakte vervormbaarheidsverlies in RBC’s kan inzicht geven in de geaccumuleerde membraanschade tijdens de bloedcirculatie, waardoor we de verbanden tussen celvermoeidheid en ziektetoestanden verder kunnen onderzoeken.
Hier bieden we stapsgewijze procedures over hoe vermoeiingstests van RBC’s worden geïmplementeerd in een microfluïdisch apparaat via ASK-gemoduleerde elektrodeformatie en de systeeminstellingen zoals microfluïdisch apparaat, mechanische belasting en microscopische verbeelding voor de karakterisering van de geleidelijke degradatie in mechanische vervormbaarheid van RBC’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ASK OOK-modulatie van een DEP-krachtinducerende sinusgolf kan worden gebruikt om de mechanische vermoeidheid van RBC’s over een lange periode te testen. In dit protocol hebben we de in vitro vermoeidheidstesten beperkt tot 1 uur om de mogelijke nadelige metabole effecten op de celvervormbaarheid te voorkomen. Uitgebreide vermoeiingstestomstandigheden kunnen worden geprogrammeerd met behulp van de ASK-gemoduleerde elektrodeformatietechniek. Parameters zoals laadfrequentie, amplitude en laadsnelheid kunnen allemaal word…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek is gefinancierd door NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) en NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
