Optimering af musens primære linseepitelcellekultur: En omfattende guide til trypsinisering
Summary
Dette manuskript skitserer en detaljeret videoprotokol til dyrkning af primære linseepitelceller (LEC’er), der sigter mod at forbedre reproducerbarheden og hjælpe forskning i grå stær og posterior kapselopacifikation (PCO). Det tilbyder trinvise instruktioner om linsedissektion, LEC-isolering og validering, der tjener som en værdifuld vejledning, især for nybegyndere i marken.
Abstract
Linseepitelceller (LEC’er) spiller flere vigtige roller i opretholdelsen af linsens homeostase og normale funktion. LEC’er bestemmer linsevækst, udvikling, størrelse og gennemsigtighed. Omvendt kan dysfunktionelle LEC’er føre til dannelse af grå stær og posterior kapselopacifikation (PCO). Derfor er etablering af et robust primært LEC-kultursystem vigtigt for forskere, der beskæftiger sig med linseudvikling, biokemi, grå stær-terapi og PCO-forebyggelse. Imidlertid har dyrkning af primære LEC’er længe givet udfordringer på grund af deres begrænsede tilgængelighed, langsomme spredningshastighed og sarte natur.
Denne undersøgelse adresserer disse forhindringer ved at præsentere en omfattende protokol for primær LEC-kultur. Protokollen omfatter væsentlige trin såsom formulering af et optimeret dyrkningsmedium, præcis isolering af linsekapsler, trypsiniseringsteknikker, subkulturprocedurer, høstprotokoller og retningslinjer for opbevaring og forsendelse. Gennem hele dyrkningsprocessen blev cellemorfologi overvåget ved hjælp af fasekontrastmikroskopi.
For at bekræfte ægtheden af de dyrkede LEC’er blev immunofluorescensassays udført for at detektere tilstedeværelsen og subcellulær fordeling af kritiske linseproteiner, nemlig αA- og γ-krystalliner. Denne detaljerede protokol udstyrer forskere med en værdifuld ressource til dyrkning og karakterisering af primære LEC’er, hvilket muliggør fremskridt i vores forståelse af linsebiologi og udvikling af terapeutiske strategier for linserelaterede lidelser.
Introduction
Linsen i øjet spiller en afgørende rolle i synet ved at fokusere indgående lys på nethinden. Den består af en gennemsigtig, avaskulær struktur sammensat af specialiserede celler, blandt hvilke linseepitelceller (LEC’er) er nøglespillere. LEC’er er placeret på objektivets forreste overflade og er ansvarlige for at opretholde dets gennemsigtighed, regulere vandbalancen og deltage i linsevækst og udvikling 1,2. LEC’er er en unik type celler placeret i den forreste del af linsen, der spiller en kritisk rolle i at opretholde linsens klarhed og funktion ved kontinuerligt at producere linsefibre gennem hele livet.
Grå stær er kendetegnet ved den progressive uklarhed af linsen, hvilket resulterer i forvrængning og spredning af lys, hvilket fører til kompromitteret syn 3,4. De præcise mekanismer, der ligger til grund for dannelse af grå stær, er komplekse og multifaktorielle og involverer forskellige cellulære og molekylære processer såsom UV-stråling, oxidativ skade og glykering 5,6. LEC’er har vist sig at bidrage væsentligt til udviklingen af grå stær, hvilket gør dem til et vigtigt fokus for forskning 1,2,7,8,9.
Desuden er et af de mest presserende problemer inden for oftalmologi i dag den relativt høje forekomst af posterior kapselopacifikation (PCO), også kendt som sekundær grå stær. PCO er fortsat den mest almindelige komplikation efter grå stær kirurgi, der påvirker op til 20-40% af voksne patienter og 100% af børn inden for 5 år efter operationen10. PCO er primært forårsaget af de resterende LEC’er, der forbliver i kapselposen efter kataraktekstraktion. Disse celler gennemgår en mangefacetteret patofysiologisk transformation, der ikke kun involverer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT), men også differentieringen af LEC’er til linsefibre, hvilket resulterer i en cellepopulation, der er en blanding af LEC’er, fibre og myofibroblaster 11,12,13. De transformerede celler formerer sig og migrerer over den bageste linsekapsel, hvilket fører til synshandicap. Forståelse af adfærd og kontrolmekanismer for LEC’er i kulturmodeller kan give værdifuld indsigt i forebyggelse og styring af PCO. Derfor præsenterer denne protokol til dyrkning af LEC’er et vigtigt værktøj for oftalmiske forskere, der sigter mod at studere, forstå og i sidste ende bekæmpe denne udbredte postoperative komplikation.
For at afklare forviklingerne i LEC-biologi og dens rolle i dannelse af grå stær og PCO er det vigtigt at etablere robuste og reproducerbare in vitro primære cellekultursystemer. Primær LEC-kultur giver forskere et kontrolleret miljø til at studere LEC’ernes funktioner, signalering og molekylære egenskaber. Desuden giver det mulighed for undersøgelse af cellulære processer og virkningerne af forskellige eksperimentelle tilstande, hvilket giver værdifuld indsigt i linsefysiologi og patologi.
Tidligere forskning har beriget vores forståelse af LEC-kulturteknikker 14,15,16,17,18,19,20. Selvom disse undersøgelser har anvendt forskellige metoder og givet betydelige fund om LEC-adfærd og egenskaber, er en omfattende og tilgængelig videooptagelsesprotokol til dyrkning af LEC’er fraværende i den nuværende litteratur. Denne begrænsning kan hindre nybegynderforskeres evne til nøjagtigt at reproducere teknikkerne og kan føre til uoverensstemmelser og variationer i eksperimentelle resultater. Ved at levere en videooptagelsesprotokol har dette forskningspapir til formål at bygge bro over dette hul og give en standardiseret ressource, der kan forbedre reproducerbarheden og lette videnoverførsel inden for LEC-kultur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der præsenteres i dette papir, giver en omfattende, trinvis vejledning til vellykket isolation, kultur og subkultur af primære LEC’er, komplet med ledsagende videodokumentation. Den detaljerede visuelle vejledning sammen med de skriftlige instruktioner forbedrer protokollens klarhed og tilgængelighed og fremmer dens anvendelse og reproducerbarhed blandt forskere på området. Det endelige mål er at bidrage til den voksende viden omkring LECs rolle i kataraktdannelse og PCO, en udbredt komplikation efter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NEI R21EY033941 (til Hongli Wu); Forsvarsministeriets W81XWH2010896 (til Hongli Wu); R15GM123463-02 (til Kayla Green og Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 발생학. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
