Optimalisering av musens primære linseepitelcellekultur: En omfattende guide til trypsinisering
Summary
Dette manuskriptet skisserer en detaljert videoprotokoll for dyrking av primære linseepitelceller (LEC), med sikte på å forbedre reproduserbarheten og hjelpe forskning i grå stær og posterior kapselopacifisering (PCO). Den tilbyr trinnvise instruksjoner om linsedisseksjon, LECs isolasjon og validering, og fungerer som en verdifull guide, spesielt for nykommere i feltet.
Abstract
Linseepitelceller (LEC) spiller flere viktige roller for å opprettholde homeostase og normal funksjon av linsen. LEC bestemmer linsevekst, utvikling, størrelse og gjennomsiktighet. Omvendt kan dysfunksjonelle LEC føre til kataraktdannelse og bakre kapselopacifisering (PCO). Derfor er etablering av et robust primært LEC-kultursystem viktig for forskere som er engasjert i linseutvikling, biokjemi, kataraktbehandling og PCO-forebygging. Dyrking av primære LEC-er har imidlertid lenge bydd på utfordringer på grunn av deres begrensede tilgjengelighet, langsomme spredningshastighet og delikate natur.
Denne studien adresserer disse hindringene ved å presentere en omfattende protokoll for primær LEC-kultur. Protokollen omfatter viktige trinn som formulering av et optimalisert kulturmedium, presis isolering av linsekapsler, trypsiniseringsteknikker, subkulturprosedyrer, høstprotokoller og retningslinjer for lagring og forsendelse. Gjennom hele dyrkningsprosessen ble cellemorfologi overvåket ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
For å bekrefte ektheten av de dyrkede LECene ble immunfluorescensanalyser utført for å oppdage tilstedeværelsen og subcellulær fordeling av kritiske linseproteiner, nemlig a- og γ-krystalliner. Denne detaljerte protokollen utstyrer forskere med en verdifull ressurs for å dyrke og karakterisere primære LECs, noe som muliggjør fremskritt i vår forståelse av linsebiologi og utvikling av terapeutiske strategier for linserelaterte lidelser.
Introduction
Linsen i øyet spiller en avgjørende rolle i synet ved å fokusere innkommende lys på netthinnen. Den består av en gjennomsiktig, avvaskulær struktur sammensatt av spesialiserte celler, blant hvilke linseepitelceller (LEC) er sentrale aktører. LEC er plassert på linsens fremre overflate og er ansvarlige for å opprettholde gjennomsiktigheten, regulere vannbalansen og delta i linsevekst og utvikling 1,2. LEC er en unik type celler som ligger i den fremre delen av linsen, og spiller en kritisk rolle for å opprettholde linsens klarhet og funksjon ved kontinuerlig å produsere linsefibre gjennom livet.
Katarakt er preget av den progressive oversvømmelsen av linsen, noe som resulterer i forvrengning og spredning av lys, noe som fører til kompromittert syn 3,4. De nøyaktige mekanismene som ligger til grunn for kataraktdannelse er komplekse og multifaktorielle, og involverer forskjellige cellulære og molekylære prosesser som UV-stråling, oksidativ skade og glykering 5,6. LEC har vist seg å bidra betydelig til utviklingen av grå stær, noe som gjør dem til et viktig fokus for forskning 1,2,7,8,9.
Videre er et av de mest presserende problemene i oftalmologi i dag den relativt høye forekomsten av posterior kapselopacifisering (PCO), også kjent som sekundær katarakt. PCO er fortsatt den vanligste komplikasjonen etter kataraktkirurgi, og påvirker opptil 20-40% av voksne pasienter og 100% av barn innen 5 år etter operasjonen10. PCO forårsakes hovedsakelig av gjenværende LEC som forblir i kapselposen etter kataraktekstraksjon. Disse cellene gjennomgår en mangesidig patofysiologisk transformasjon som involverer ikke bare epithelial-til-mesenkymal overgang (EMT), men også differensiering av LEC til linsefibre, noe som resulterer i en cellepopulasjon som er en blanding av LEC, fibre og myofibroblaster 11,12,13. De transformerte cellene prolifererer og migrerer over den bakre linsekapselen, noe som fører til synshemming. Å forstå atferden og kontrollmekanismene til LEC i kulturmodeller kan gi verdifull innsikt i forebygging og håndtering av PCO. Derfor presenterer denne protokollen for dyrking av LEC et viktig verktøy for oftalmiske forskere som tar sikte på å studere, forstå og til slutt bekjempe denne utbredte postoperative komplikasjonen.
For å avdekke vanskelighetene med LEC-biologi og dens rolle i kataraktdannelse og PCO, er det viktig å etablere robuste og reproduserbare in vitro primære cellekultursystemer. Primær LEC-kultur gir forskere et kontrollert miljø for å studere funksjoner, signalering og molekylære egenskaper av LECer. Videre tillater det undersøkelse av cellulære prosesser og effekten av forskjellige eksperimentelle forhold, noe som gir verdifull innsikt i linsefysiologi og patologi.
Tidligere forskning har beriket vår forståelse av LEC kultur teknikker 14,15,16,17,18,19,20. Selv om disse studiene har benyttet ulike metoder og gitt betydelige funn om LEC-oppførsel og egenskaper, er en omfattende og tilgjengelig videoopptaksprotokoll for dyrking av LEC fraværende i dagens litteratur. Denne begrensningen kan hindre nybegynneres evne til å reprodusere teknikkene nøyaktig og kan føre til inkonsekvenser og variasjoner i eksperimentelle resultater. Ved å tilby en videoopptaksprotokoll, har dette forskningspapiret som mål å bygge bro over dette gapet og gi en standardisert ressurs som kan forbedre reproduserbarheten og lette kunnskapsoverføringen innen LEC-kultur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres i denne artikkelen gir en omfattende, trinnvis veiledning til vellykket isolasjon, kultur og subkultur av primære LEC-er, komplett med tilhørende videodokumentasjon. Den detaljerte visuelle veiledningen sammen med de skriftlige instruksjonene forbedrer klarheten og tilgjengeligheten til protokollen, og fremmer bruken og reproduserbarheten blant forskere på feltet. Det endelige målet er å bidra til den voksende kunnskapskunnskapen rundt LECs rolle i kataraktdannelse og PCO, en utbredt komp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NEI R21EY033941 (til Hongli Wu); Forsvarsdepartementets W81XWH2010896 (til Hongli Wu); R15GM123463-02 (til Kayla Green og Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 발생학. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
