Optimización del cultivo de células epiteliales del cristalino primario de ratón: una guía completa para la tripsinización
Summary
Este manuscrito describe un protocolo de video detallado para el cultivo de células epiteliales del cristalino primario (LEC), con el objetivo de mejorar la reproducibilidad y ayudar a la investigación en cataratas y opacificación de la cápsula posterior (PCO). Ofrece instrucciones paso a paso sobre la disección de lentes, el aislamiento de LEC y la validación, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al campo.
Abstract
Las células epiteliales del cristalino (LEC, por sus siglas en inglés) desempeñan múltiples funciones importantes en el mantenimiento de la homeostasis y la función normal del cristalino. Los LEC determinan el crecimiento, el desarrollo, el tamaño y la transparencia de las lentes. Por el contrario, las LEC disfuncionales pueden conducir a la formación de cataratas y a la opacificación de la cápsula posterior (OCP). En consecuencia, el establecimiento de un sistema robusto de cultivo primario de LEC es importante para los investigadores que se dedican al desarrollo de lentes, la bioquímica, la terapéutica de cataratas y la prevención del SOP. Sin embargo, el cultivo de LEC primarios ha presentado desafíos durante mucho tiempo debido a su disponibilidad limitada, su lenta tasa de proliferación y su naturaleza delicada.
Este estudio aborda estos obstáculos mediante la presentación de un protocolo integral para el cultivo primario de LEC. El protocolo abarca pasos esenciales como la formulación de un medio de cultivo optimizado, el aislamiento preciso de las cápsulas de cristalino, las técnicas de tripsinización, los procedimientos de subcultivo, los protocolos de cosecha y las directrices para el almacenamiento y el envío. A lo largo del proceso de cultivo, se monitorizó la morfología celular mediante microscopía de contraste de fase.
Para confirmar la autenticidad de las LEC cultivadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para detectar la presencia y distribución subcelular de proteínas críticas del cristalino, a saber, αA- y γ-cristalinas. Este protocolo detallado equipa a los investigadores con un recurso valioso para cultivar y caracterizar las LEC primarias, lo que permite avances en nuestra comprensión de la biología del cristalino y el desarrollo de estrategias terapéuticas para los trastornos relacionados con el cristalino.
Introduction
El cristalino del ojo desempeña un papel crucial en la visión al enfocar la luz entrante en la retina. Consiste en una estructura transparente y avascular compuesta por células especializadas, entre las cuales las células epiteliales del cristalino (LEC) son actores clave. Las LEC se localizan en la superficie anterior del cristalino y son responsables de mantener su transparencia, regular el equilibrio hídrico y participar en el crecimiento y desarrollo del cristalino 1,2. Las LEC son un tipo único de células ubicadas en la parte anterior del cristalino, que desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la claridad y la función del cristalino mediante la producción continua de fibras del cristalino a lo largo de la vida.
Las cataratas se caracterizan por la opacidad progresiva del cristalino, lo que resulta en la distorsión y dispersión de la luz, lo que lleva a una visión comprometida 3,4. Los mecanismos precisos que subyacen a la formación de cataratas son complejos y multifactoriales, e involucran diversos procesos celulares y moleculares como la radiación UV, el daño oxidativo y la glicación 5,6. Se ha encontrado que las LEC contribuyen significativamente al desarrollo de cataratas, lo que las convierte en un foco vital de investigación 1,2,7,8,9.
Además, uno de los problemas más apremiantes en oftalmología hoy en día es la incidencia relativamente alta de opacificación de la cápsula posterior (OCP), también conocida como catarata secundaria. El SOP sigue siendo la complicación más frecuente después de la cirugía de cataratas, afectando hasta al 20-40% de los pacientes adultos y al 100% de los niños dentro de los 5 años posteriores a la cirugía10. El SOP es causado principalmente por los LEC residuales que permanecen en la bolsa capsular después de la extracción de cataratas. Estas células experimentan una transformación fisiopatológica multifacética que involucra no solo la transición epitelial a mesenquimal (EMT), sino también la diferenciación de las LEC a las fibras del cristalino, lo que da como resultado una población celular que es una mezcla de LEC, fibras y miofibroblastos 11,12,13. Las células transformadas proliferan y migran a través de la cápsula posterior del cristalino, lo que provoca discapacidad visual. Comprender el comportamiento y los mecanismos de control de los LEC en los modelos de cultivo puede proporcionar información valiosa sobre la prevención y el tratamiento del PCO. Por lo tanto, este protocolo de cultivo de LEC presenta una herramienta vital para los investigadores oftalmológicos que buscan estudiar, comprender y, en última instancia, combatir esta complicación postoperatoria prevalente.
Para desentrañar las complejidades de la biología de la LEC y su papel en la formación de cataratas y PCO, es esencial establecer sistemas de cultivo celular primario in vitro robustos y reproducibles. El cultivo primario de LEC proporciona a los investigadores un entorno controlado para estudiar las funciones, la señalización y las características moleculares de las LEC. Además, permite la investigación de los procesos celulares y los efectos de diferentes condiciones experimentales, proporcionando información valiosa sobre la fisiología y la patología del cristalino.
Investigaciones previas han enriquecido nuestra comprensión de las técnicas de cultivo LEC 14,15,16,17,18,19,20. Aunque estos estudios han empleado diversas metodologías y han arrojado hallazgos significativos sobre el comportamiento y las características de los LEC, en la literatura actual no existe un protocolo de grabación de video completo y accesible para el cultivo de LEC. Esta limitación puede dificultar la capacidad de los investigadores novatos para reproducir con precisión las técnicas y puede dar lugar a inconsistencias y variaciones en los resultados experimentales. Al proporcionar un protocolo de grabación de video, este trabajo de investigación tiene como objetivo cerrar esta brecha y proporcionar un recurso estandarizado que pueda mejorar la reproducibilidad y facilitar la transferencia de conocimiento en el campo de la cultura LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado en este documento proporciona una guía completa, paso a paso, para el aislamiento, la cultura y la subcultura exitosos de los LEC primarios, con documentación en video que lo acompaña. La guía visual detallada junto con las instrucciones escritas mejora la claridad y accesibilidad del protocolo, promoviendo su uso y reproducibilidad entre los investigadores en el campo. El objetivo final es contribuir a la expansión del cuerpo de conocimientos en torno al papel de las LEC en la formación de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Departamento de Defensa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green y Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 발생학. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
