रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की एक स्थिर और स्वस्थ मस्तिष्क वातावरण को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका है। बीबीबी डिसफंक्शन कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों से जुड़ा हुआ है। हमने सेरेब्रोवास्कुलर पैथोलॉजी, बीबीबी अखंडता की जांच करने के लिए बीबीबी का एक 3 डी, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न मॉडल विकसित किया है, और बीबीबी को आनुवंशिकी और बीमारी से कैसे बदल दिया जाता है।
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक प्रमुख शारीरिक घटक है, पोषक तत्वों को बनाए रखता है, अपशिष्ट को साफ करता है, और मस्तिष्क को रोगजनकों से बचाता है। बीबीबी के अंतर्निहित बाधा गुण न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए सीएनएस में चिकित्सीय दवा वितरण के लिए एक चुनौती पैदा करते हैं। बिगड़ा हुआ बीबीबी फ़ंक्शन न्यूरोलॉजिकल बीमारी से संबंधित है। सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए), सेरेब्रल वास्कुलचर में अमाइलॉइड का जमाव एक समझौता बीबीबी की ओर जाता है, अल्जाइमर रोग (एडी) के अधिकांश मामलों में एक सह-रुग्णता है, यह सुझाव देता है कि बीबीबी की शिथिलता या टूटना न्यूरोडीजेनेरेशन में शामिल हो सकता है। मानव बीबीबी ऊतक तक सीमित पहुंच के कारण, उचित बीबीबी फ़ंक्शन और बीबीबी अध: पतन में योगदान देने वाले तंत्र अज्ञात रहते हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने 3 डी मैट्रिक्स में एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को शामिल करके एक मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीबीबी (आईबीबीबी) विकसित किया है। आईबीबीबीबी बीबीबी में मौजूद शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर इंटरैक्शन को पुन: व्यवस्थित करने के लिए स्वयं को इकट्ठा करता है। अमाइलॉइड के साथ iBBBs सीडिंग CAA के प्रमुख पहलुओं को पकड़ती है। इसके अतिरिक्त, iBBB सेरेब्रोवास्कुलर रोग और न्यूरोडीजेनेरेशन में फंसे आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों को संशोधित करने के लिए एक लचीला मंच प्रदान करता है, यह जांचने के लिए कि आनुवंशिकी और जीवन शैली रोग जोखिम को कैसे प्रभावित करती है। अंत में, iBBB दवा स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सीएनएस के लिए चिकित्सीय वितरण का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली तीन प्रकार की कोशिकाओं (एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स) के भेदभाव का वर्णन करते हैं, आईबीबीबीबी में विभेदित कोशिकाओं को कैसे इकट्ठा किया जाए, और बहिर्जात एमिलॉयड का उपयोग करके इन विट्रो में सीएए को कैसे मॉडल किया जाए। यह मॉडल एक ऐसी प्रणाली के साथ जीवित मानव मस्तिष्क के ऊतकों का अध्ययन करने की चुनौती पर काबू पाता है जिसमें जैविक निष्ठा और प्रयोगात्मक लचीलापन दोनों होते हैं, और मानव बीबीबी की पूछताछ और न्यूरोडीजेनेरेशन में इसकी भूमिका को सक्षम बनाता है।
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक प्रमुख माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क है जो उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए एक आदर्श वातावरण बनाए रखने के लिए परिधि से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को अलग करता है। चयापचय होमियोस्टेसिस 1,2,3,4 को बनाए रखने, अपशिष्ट 4,5,6 को साफ करने और रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों 7,8 से मस्तिष्क की रक्षा करके सीएनएस में पदार्थों की आमद और प्रवाह को विनियमित करने में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका है।
बीबीबी का प्राथमिक सेल प्रकार एंडोथेलियल सेल (ईसी) है। एंडोथेलियल कोशिकाएं, मेसोडर्म वंश से व्युत्पन्न, वास्कुलचर 1,9 की दीवारों का निर्माण करती हैं। माइक्रोवैस्कुलर ईसी एक दूसरे के साथ तंग जंक्शन बनाते हैं ताकि उनकी झिल्ली 10,11,12,13,14 की पारगम्यता को कम किया जा सके, जबकि ट्रांसपोर्टरों को सीएनएस 1,4,12,14 में पोषक तत्वों की आवाजाही को सुविधाजनक बनाने के लिए व्यक्त किया जा सके . माइक्रोवैस्कुलर ईसी पेरिसाइट्स (पीसी) -भित्ति कोशिकाओं से घिरे होते हैं जो माइक्रोवैस्कुलर फ़ंक्शन और होमियोस्टेसिस को विनियमित करते हैं और अणुओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं 15,16,17के लिए बीबीबी की पारगम्यता को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एस्ट्रोसाइट, एक प्रमुख ग्लियल सेल प्रकार, बीबीबी में शामिल अंतिम सेल प्रकार है। एस्ट्रोसाइट अंत-पैर ईसी-पीसी संवहनी ट्यूबों के चारों ओर लपेटते हैं जबकि कोशिका शरीर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में विस्तारित होते हैं, जिससे न्यूरॉन्स और वास्कुलचर1 के बीच संबंध बनता है। विशिष्ट विलेय और सब्सट्रेट ट्रांसपोर्टर एस्ट्रोसाइट एंड-फीट (जैसे, एक्वापोरिन 4 [एक्यूपी -4]) पर स्थानीयकृत होते हैं जिनकी बीबीबी फ़ंक्शन 18,19,20,21में महत्वपूर्ण भूमिका होती है।
बीबीबी उचित मस्तिष्क स्वास्थ्य समारोह को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है, और बीबीबी की शिथिलता अल्जाइमर रोग (एडी) 22,23,24,25, मल्टीपल स्केलेरोसिस 7,26,27,28, मिर्गी 29,30 और स्ट्रोक31,32 सहित कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में बताई गई है. यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि सेरेब्रोवास्कुलर असामान्यताएं न्यूरोडीजेनेरेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं, इस्केमिक और रक्तस्रावी घटनाओं के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि में योगदान करती हैं। उदाहरण के लिए, 90% से अधिक एडी रोगियों में सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए) होती है, जो मस्तिष्क वाहिका के साथ अमाइलॉइड β (एβ) के जमाव की विशेषता वाली स्थिति है। सीएए बीबीबी पारगम्यता बढ़ जाती है और बीबीबी समारोह कम हो जाती है, सीएनएस इस्किमिया, रक्तस्रावी घटनाओं के लिए कमजोर छोड़ने, और त्वरित संज्ञानात्मक गिरावट33.
हमने हाल ही में मानव बीबीबी के इन विट्रो मॉडल में विकसित किया है, जो रोगी-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होता है, जिसमें ईसी, पीसी, और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं जो 3 डी मैट्रिक्स(चित्रा 1ए)में समाहित हैं। आईबीबीबीबी शारीरिक रूप से प्रासंगिक इंटरैक्शन को पुन: प्रस्तुत करता है, जिसमें संवहनी ट्यूब गठन और वास्कुलचर24 के साथ एस्ट्रोसाइट एंड-फीट का स्थानीयकरण शामिल है। हमने एपीओई 4 (चित्रा 1 बी) द्वारा मध्यस्थता सीएए की संवेदनशीलता को मॉडल करने के लिए आईबीबीबीबी लागू किया। इसने हमें कारण सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने में सक्षम बनाया जिसके द्वारा APOE4 CAA को बढ़ावा देता है, और चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए इन अंतर्दृष्टि का लाभ उठाता है जो CAA पैथोलॉजी को कम करता है और APOE4 चूहों24 में विवो में सीखने और स्मृति में सुधार करता है। यहां, हम मानव आईपीएससी से बीबीबी के पुनर्निर्माण और इन विट्रो में सीएए मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और वीडियो ट्यूटोरियल प्रदान करते हैं।
बीबीबी डिसफंक्शन एक सह-रुग्णता है, और संभावित रूप से, कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में एक कारण या उत्तेजक कारक 7,40,41. हालांकि, न्यूरोवास्कुलर रोग वाले मनुष्यों में बीबीबी की श…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच 3-यूजी 3-NS115064-01, R01NS14239, क्योर अल्जाइमर फंड, नासा 80ARCO22CA004, चान-जुकरबर्ग इनिशिएटिव, एमजेएफएफ / एएसएपी फाउंडेशन और ब्रेन इंजरी एसोसिएशन ऑफ अमेरिका द्वारा समर्थित है। सीजी एनआईएच F31NS130909 द्वारा समर्थित है। चित्रा 1 ए BioRender.com के साथ बनाया गया था।
6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Activin A | Peprotech | 20-14E | |
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
LDN193189 | Tocris | 6053 | |
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |