Method Article

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

DOI:

10.3791/65921

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

Abstract

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혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)의 핵심 생리학적 구성 요소로, 영양분을 유지하고 노폐물을 제거하며 병원균으로부터 뇌를 보호합니다. BBB의 고유한 장벽 특성은 신경 질환을 치료하기 위해 CNS로의 치료 약물 전달에 어려움을 제기합니다. BBB 기능 장애는 신경 질환과 관련이 있습니다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 대뇌 혈관에 아밀로이드가 침착되어 BBB가 손상되는 현상으로, 알츠하이머병(AD)의 대부분의 경우 동반 질환으로, BBB 기능 장애 또는 고장이 신경 퇴행에 관여할 수 있음을 시사합니다. 인간 BBB 조직에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 적절한 BBB 기능과 BBB 변성에 기여하는 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 3D 매트릭스에 통합하여 인간 만능 줄기 세포 유래 BBB(iBBB)를 개발했습니다. iBBB는 BBB에 존재하는 해부학적 구조와 세포 상호 작용을 요약하기 위해 자체 조립됩니다. iBBB에 아밀로이드를 파종하면 CAA의 주요 측면을 포착할 수 있습니다. 또한 iBBB는 뇌혈관 질환 및 신경 퇴행과 관련된 유전적 및 환경적 요인을 조절하여 유전학 및 생활 방식이 질병 위험에 미치는 영향을 조사할 수 있는 유연한 플랫폼을 제공합니다. 마지막으로, iBBB는 중추신경계에 대한 치료 전달을 최적화하기 위해 약물 스크리닝 및 의약 화학 연구에 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 인간 만능줄기세포에서 발생하는 3가지 유형의 세포(내피세포, 주위세포, 성상교세포)의 분화, 분화된 세포를 iBBB로 조립하는 방법, 외인성 아밀로이드를 이용하여 in vitro 에서 CAA를 모델링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 생물학적 충실도와 실험적 유연성을 모두 갖춘 시스템으로 살아있는 인간 뇌 조직을 연구하는 문제를 극복하고 인간 BBB와 신경 퇴행에서의 역할을 조사할 수 있습니다.

Introduction

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혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)를 말초에서 분리하여 적절한 신경 기능을 위한 이상적인 환경을 유지하는 핵심 미세혈관 네트워크입니다. 뇌는 대사 항상성 1,2,3,4를 유지하고, 노폐물 4,5,6을 제거하며, 병원균과 독소로부터 뇌를 보호함으로써 중추신경계로의 물질 유입과 유출을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 7,8.

BBB의 일차 세포 유형은 내피 세포(EC)입니다. 중배엽 계통에서 유래 한 내피 세포는 혈관 (vasculature) 1,9의 벽을 형성합니다. 미세혈관 EC는 서로 긴밀한 접합부를 형성하여 막의 투과성을 크게 감소<....

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Protocol

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1. iPSC를 iBBB 세포로 분화

참고: 이러한 차별화 프로토콜은 이전에 Mesentier-Louro et al.34에서 설명되었습니다.

  1. 코팅 세포 배양 플레이트
    1. 감소된 성장 인자(GF) 막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. 500μL의 기저막 매트릭스를 49.5mL의 DMEM에 희석합니다. 코팅 용액의 조기 중합을 방지하기 위해 이 용액을 차갑게 유지하십시오.
    2. 6웰 조직 배양 처리 플레이트의 웰당 1-2mL를 추가합니다. 코팅 용액을 37°C에서 최소 20분 동안 그대로 두었다가 적절한 가열된 배양 배지로 교체합니다.
  2. 인간 iPSC를 ETV2 유도 내피 세포로 분화
    타이밍 : 8 일
    참고: 이 프로토콜은 Blanchard et al.24 및 Qian et al.35에서 채택되었습니다. 수율을 개선하기 위해 Wang et al.36 에 의해 설명된 전사 인자 ETV2의 독시사이클린 유도 발현을 사용합니다. ETV2는 PiggyBac 플....

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Results

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적절하게 형성된 iBBB는 하나의 반투명 디스크로 응고됩니다(그림 3A). iBBB가 며칠 후에 처음 피펫팅된 표면에서 분리되는 것은 정상입니다. 이것은 피할 수 없지만 실수로 iBBB를 흡입하지 않도록 매체를 교체할 때 주의를 기울인다면 iBBB의 적절한 형성에 큰 문제가 되지 않습니다. 24시간 후 균일하게 분포된 단일 세포를 명시야 현미경으로 식별할 수 있습니다(그림 3B). 2주 후에는 더 뚜렷한 구조를 볼 수 있지만 명확하게 식별하기는 어렵습니다(그림 3C).

iBBB의 품질은 입력 셀의 분화 품질에 크게 좌우됩니다. 세포 유형 특이적 마커를 고정하고 염색하기 위해 2D 단일 배양에서 일부 남은 세포를 도금하는 것이 좋습니다. PECAM1 또는 VE-cadherin에 대해 70% 이상 양성인 내피 세포(

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Discussion

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BBB 기능 장애는 동반 질환이며, 잠재적으로 수많은 신경 질환의 원인 또는 악화 요인이 될 수 있다 7,40,41. 그러나 신경 혈관 질환이 있는 인간에서 BBB의 기능 장애 및 고장의 기저에 있는 분자 및 세포 생물학을 연구하는 것은 거의 불가능합니다. 이 프로토콜에 제시된 유도 BBB(iBBB)는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 국소화를 포함하여 BBB의 중요한 세포 상호 작용을 요약하는 시험관 내 시스템을 제공합니다. iBBB는 BBB 기능 장애의 모든 단계와 관련된 분자 경로를 연구하는 데 사용할 수 있으며 뇌 아밀로이드 혈관병증에서 볼 수 있듯이 아밀로이드 β 응집과 같은 신경 혈관 질환 표현형을 모델링할 수 있습니다.

iBBB의 조립은 간단하지만, iBBB의 품질은 사용되는.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation 및 Brain Injury Association of America의 지원을 받습니다. C.G.는 NIH F31NS130909의 지원을 받습니다. 그림 1A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 아밀로이드-&베타; 항체BiolegendSIG-393201:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 2차 항체InvitrogenVarious1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235 사용
아밀로이드-베타 42 피브릴AnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 항체InvitrogenPA5-532341:300
성상세포 기저 매체 및 보충제ScienCell1801
B-27 무혈청 보충제Gibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G 슬라이드 장착 매체VWR100502-406
ForskolinR& D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC 인증 감소된 성장 인자 지하실 GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX 보충제Gibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
인간 내피 혈청이 없는 매체Gibco11111044
LDN193189Tocris6053
최소 필수 매체 비필수 아미노산 용액 (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 보충제Gibco17502048
Neurobasal 매체Gibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mL와 일치하는 세럼을 사용하십시오
.ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB(혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타) 항체R& 1:500
Pecam1(혈소판 내피 세포 접착 분자 1) 항체R&에서 사용되는 D Systems AF385 D SystemsAF8061:500
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122
PiggyBac 플라스미드 (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  카탈로그 #168805
S100B 항체Sigma-AldrichS2532-100uL1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex2287025uM
Triton X-100 에서 사용;Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin(CD144) 항체R& D 시스템AF9381:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488희석 = 1:500
2차 항체 호스트 파라포름알데히드 (PFA)인산완충식염수(PBS), pH 7.4 Gibco 10010031

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021)....

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