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신경과학

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。

Abstract

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)の重要な生理学的構成要素であり、栄養素を維持し、老廃物を取り除き、病原体から脳を保護します。BBBの固有のバリア特性は、神経疾患を治療するための中枢神経系への治療薬送達に課題を提起します。BBB機能障害は神経疾患に関連しています。脳血管系にアミロイドが沈着してBBBが損なわれる脳アミロイド血管症(CAA)は、アルツハイマー病(AD)のほとんどの症例で併存疾患であり、BBBの機能不全または破壊が神経変性に関与している可能性があることを示唆しています。ヒトBBB組織へのアクセスが限られているため、適切なBBB機能とBBB変性に寄与するメカニズムは不明のままです。これらの限界に対処するために、私たちは、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスに組み込むことにより、ヒト多能性幹細胞由来BBB(iBBB)を開発しました。iBBBは自己組織化して、BBBに存在する解剖学的構造と細胞相互作用を再現します。iBBBにアミロイドを播種することで、CAAの重要な側面を捉えることができます。さらに、iBBBは、脳血管疾患や神経変性に関与する遺伝的要因や環境要因を調節し、遺伝学や生活習慣が疾患リスクにどのように影響するかを調査するための柔軟なプラットフォームを提供します。最後に、iBBBは、中枢神経系への治療送達を最適化するための薬物スクリーニングおよび創薬化学研究に使用できます。このプロトコルでは、ヒト多能性幹細胞から生じる3種類の細胞(内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト)の微分、iBBBに分化した細胞を組み立てる方法、および外因性アミロイドを使用して生体 外で CAAをモデル化する方法について説明します。このモデルは、生物学的忠実度と実験の柔軟性の両方を備えたシステムを使用して、生きたヒト脳組織を研究するという課題を克服し、ヒトBBBと神経変性におけるその役割の調査を可能にします。

Introduction

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)を末梢から分離し、適切な神経機能に理想的な環境を維持する重要な微小血管ネットワークです。代謝ホメオスタシスを維持し1,2,3,4、老廃物4,5,6を除去し、病原体や毒素から脳を保護することにより、中枢神経系への物質の流入と流出を調節する上で重要な役割を果たします7,8。

BBBの一次細胞型は内皮細胞(EC)です。中胚葉系統に由来する内皮細胞は、血管系の壁を形成します1,9。微小血管ECは互いにタイトジャンクションを形成して膜の透過性を大幅に低下させる一方で、トランスポーターを発現して中枢神経系への栄養素の出入りを促進する10,11,12,13,14.微小血管ECは、微小血管機能と恒常性を調節する周皮細胞(PC)壁細胞に囲まれており、分子および免疫細胞に対するBBBの透過性を調節するために重要です15,16,17。主要なグリア細胞型であるアストロサイトは、BBBを含む最後の細胞型です。アストロサイトの末端足はEC-PC血管管を包み込み、細胞体は脳実質に伸び、ニューロンと血管系の間の接続を形成します1。BBB機能に重要な役割を果たすアストロサイト末端(アクアポリン4[AQP-4]など)には、異なる溶質および基質トランスポーターが局在しています18,19,20,21。

BBBは脳の健康機能の維持に不可欠であり、アルツハイマー病(AD)22,23,24,25、多発性硬化症7,26,27,28、てんかん29,30、脳卒中31,32など、多くの神経疾患でBBBの機能不全が報告されています.脳血管の異常が神経変性において中心的な役割を果たし、虚血性および出血性イベントに対する感受性の増加に寄与していることがますます認識されています。例えば、AD患者の90%以上が、脳血管系に沿ってアミロイドβ(Aβ)が沈着することを特徴とする脳アミロイド血管障害(CAA)を患っています。CAAはBBBの透過性を高め、BBB機能を低下させ、中枢神経系を虚血、出血性イベント、および加速された認知機能低下に対して脆弱なままにします33。

私たちは最近、3Dマトリックスにカプセル化されたEC、PC、およびアストロサイトを組み込んだ、患者誘発多能性幹細胞に由来するヒトBBBの in vitro モデルを開発しました(図1A)。iBBBは、血管管の形成や血管系によるアストロサイトのエンドフットの局在化など、生理学的に関連する相互作用を再現します24。APOE4が媒介するCAAの感受性をモデル化するためにiBBBを適用しました(図1B)。これにより、APOE4がCAAを促進する原因となる細胞および分子メカニズムを特定し、これらの洞察を活用して、APOE4マウスのCAA病理を低減し、 in vivoでの 学習と記憶を改善する治療戦略を開発することができました24。ここでは、ヒトiPS細胞からBBBを再構築し、 in vitroでCAAをモデル化するための詳細なプロトコルとビデオチュートリアルを提供します。

Protocol

1. iPS細胞からiBBB細胞への分化 注:これらの分化プロトコルは、Mesentier-Louro et al.34で以前に説明されています。 細胞培養プレートのコーティング還元成長因子(GF)メンブレンマトリックスを4°Cで一晩融解します。 500 μL の基底膜マトリックスを 49.5 mL の DMEM で希釈します。コーティング液の早期重合を防ぐために、この溶液を冷?…

Representative Results

適切に形成されたiBBBは、1つの半透明のディスクに固化します(図3A)。iBBBは、数日後に最初にピペットで固定した表面から剥がれるのが普通です。これは避けることはできませんが、培地を交換する際に誤ってiBBBを吸引しないように注意すれば、iBBBの適切な形成にとって大きな懸念事項ではありません。24時間後、明視野顕微鏡で均一に分布した単一細胞を同定できま?…

Discussion

BBB機能障害は併存疾患であり、多くの神経疾患の原因または悪化因子である可能性があります7,40,41。しかし、神経血管疾患のヒトにおけるBBBの機能不全と破壊の根底にある分子生物学および細胞生物学を研究することはほぼ不可能です。このプロトコルで示される誘導性BBB (iBBB)は管管の形成および血管系のastrocyte端フィ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH 3-UG3-NS115064-01、R01NS14239、Cure Alzheimer’s Fund、NASA 80ARCO22CA004、Chan-Zuckerberg Initiative、MJFF/ASAP Foundation、Brain Injury Association of Americaの支援を受けています。C.G.はNIH F31NS130909によってサポートされています。 図 1A は BioRender.com で作成されました。

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
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References

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Keywords: Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy
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Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
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