Valorisering af den røde tang Gracilaria gracilis gennem en bioraffinaderitilgang

Summary

Her beskriver vi flere protokoller, der sigter mod en integreret valorisering af Gracilaria gracilis: høst af vilde arter, intern vækst og udvinding af bioaktive ingredienser. Ekstrakternes antioxidante, antimikrobielle og cytotoksiske virkninger evalueres sammen med ernærings- og stabilitetsvurderingen af fødevarer beriget med hele tangbiomasse og pigmenter.

Abstract

Interessen for tang som et rigeligt råmateriale til at opnå værdifulde og multitarget bioaktive ingredienser vokser konstant. I dette arbejde undersøger vi potentialet i Gracilaria gracilis, en spiselig rød tang, der dyrkes over hele verden for sin kommercielle interesse som kilde til agar og andre ingredienser til kosmetiske, farmakologiske, fødevare- og foderapplikationer.

G. gracilis vækstbetingelser blev optimeret gennem vegetativ formering og sporulation, mens de fysisk-kemiske forhold blev manipuleret for at opnå en stor biomassebestand. Grønne ekstraktionsmetoder med ethanol og vand blev udført over tangbiomassen. Det bioaktive potentiale af ekstrakter blev vurderet gennem et sæt in vitro assays vedrørende deres cytotoksicitet, antioxidant og antimikrobielle egenskaber. Derudover blev tørret tangbiomasse inkorporeret i pastaformuleringer for at øge fødevarens næringsværdi. Pigmenter ekstraheret fra G. gracilis er også blevet indarbejdet i yoghurt som et naturligt farvestof, og deres stabilitet blev evalueret. Begge produkter blev påskønnet af et semi-trænet sensorisk panel, der sigter mod at opnå den bedste endelige formulering, før de når markedet.

Resultaterne understøtter alsidigheden af G. gracilis , uanset om det anvendes som en hel biomasse, ekstrakter og / eller pigmenter. Ved at implementere flere optimerede protokoller muliggør dette arbejde udvikling af produkter med potentiale til at gavne fødevare-, kosmetik- og akvakulturmarkederne, fremme miljømæssig bæredygtighed og en blå cirkulær økonomi.

Desuden og i overensstemmelse med en bioraffinaderitilgang vil den resterende tangbiomasse blive anvendt som biostimulans til plantevækst eller omdannet til kulstofmaterialer, der skal bruges til vandrensning af de interne akvakultursystemer i MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

Introduction

Tang kan betragtes som et interessant naturligt råmateriale, der kan profiteres af medicinal-, fødevare-, foder- og miljøsektorerne. De biosyntetiserer en række molekyler, hvoraf mange ikke findes i landorganismer, med relevante biologiske egenskaber ^1,2. Der skal dog implementeres tangoptimerede dyrkningsprotokoller for at sikre et stort biomasselager.

Dyrkningsmetoder skal altid tage hensyn til tangthalliens art og den overordnede morfologi. Gracilaria gracilis er et klonalt taxon, hvilket betyder, at fastgørelsesorganet producerer flere vegetative akser. Formering ved fragmentering (vegetativ reproduktion) opnås således, da hver af disse akser fuldt ud er i stand til at vedtage et uafhængigt liv fra hovedthallusen³. Klontaxa kan med succes integreres med enkle og hurtige et-trins dyrkningsmetoder, da store mængder biomasse opnås ved at opdele thallusen i små fragmenter, der hurtigt regenererer og vokser til nye, genetisk identiske individer. Både haplontisk og diplontisk thalli kan anvendes i denne proces. Selvom slægten udviser en kompleks haplo-diplontisk isomorf triphasisk livscyklus, er sporulation sjældent nødvendig, undtagen når genetisk fornyelse af bestandene er nødvendig for at opnå forbedrede afgrøder. I dette tilfælde giver både tetrasporer (haplontiske sporer dannet af meiose) og carposporer (diplontiske sporer dannet af mitose) anledning til makroskopiske thalli, som derefter kan dyrkes og formeres ved vegetativ reproduktion⁴. Vækstcyklusser dikteres af miljøforhold og individernes fysiologiske tilstand, blandt andre biologiske faktorer såsom fremkomsten af epifytter og vedhæftningen af andre organismer. Derfor er optimering af vækstbetingelser afgørende for at sikre høj produktivitet og producere biomasse af god kvalitet⁵.

Ekstraktion af bioaktive forbindelser fra tang, herunder G. gracilis, kan opnås ved forskellige metoder ^6,7. Valget af ekstraktionsmetode afhænger af de specifikke forbindelser af interesse, målanvendelsen og tangens egenskaber. I denne undersøgelse fokuserede vi på opløsningsmiddelekstraktion, som involverer brug af grønne opløsningsmidler, såsom vand eller ethanol, til at opløse og ekstrahere bioaktive forbindelser fra tangbiomassen. Ekstraktionen kan udføres gennem maceration på en alsidig og effektiv måde og kan bruges til en lang række forbindelser. Det er en enkel og udbredt metode, der involverer iblødsætning af biomasse i et opløsningsmiddel i en længere periode, typisk ved stuetemperatur eller let forhøjede temperaturer. Opløsningsmidlet omrøres for at forbedre ekstraktionsprocessen. Efter den ønskede ekstraktionstid adskilles opløsningsmidlet fra det faste materiale ved filtrering eller centrifugering.

Vand er et almindeligt anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer på grund af dets sikkerhed, tilgængelighed og kompatibilitet med en lang række fødevarer. Vandekstraktion er velegnet til polære forbindelser såsom polysaccharider, peptider og visse phenoler. Det kan dog ikke effektivt ekstrahere ikke-polære forbindelser. Ethanol er også et meget anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer og kan være effektivt til ekstraktion af en række bioaktive molekyler, herunder phenolforbindelser, flavonoider og visse pigmenter. Ethanol er generelt anerkendt som sikkert til brug i fødevarer og kan let fordampes og efterlade de ekstraherede forbindelser. Det er værd at bemærke, at valget af ekstraktionsmetode bør overveje faktorer som effektivitet, selektivitet, omkostningseffektivitet og miljøpåvirkning. Optimering af ekstraktionsparametre, såsom opløsningsmiddelkoncentration, ekstraktionstid, temperatur og tryk, er afgørende for at opnå optimale udbytter af bioaktive forbindelser fra G. gracilis eller andre tangplanter.

Tang har vist sig at udvise antimikrobiel aktivitet mod en lang række mikroorganismer, herunder bakterier, svampe og vira⁸. Denne aktivitet tilskrives bioaktive komponenter, herunder phenoler, polysaccharider, peptider og fedtsyrer. Flere undersøgelser har vist deres effektivitet mod patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. og Pseudomonas aeruginosa, blandt andre⁹. Den antimikrobielle aktivitet af tang tilskrives tilstedeværelsen af bioaktive forbindelser, der kan forstyrre mikrobielle cellevægge, membraner, enzymer og signalveje¹⁰. Disse forbindelser kan forstyrre mikrobiel vækst, hæmme biofilmdannelse og modulere immunresponser.

Rød tang, også kendt som rhodophytes, er en gruppe alger, der kan udvise antimikrobiel aktivitet mod en række mikroorganismer. Inden for denne gruppe indeholder G. gracilis forskellige bioaktive forbindelser, der kan bidrage til dets rapporterede antimikrobielle aktivitet. Mens de specifikke molekyler kan variere, er de almindelige klasser, der er blevet rapporteret i G. gracilis og kan have antimikrobielle egenskaber, polysaccharider, phenoler, terpenoider og pigmenter¹¹. Det er dog vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen og mængderne af disse komponenter kan variere afhængigt af faktorer som placeringen af tangopsamling, sæsonbestemthed, tallis fysiologiske tilstand og miljøforhold. Derfor kan den specifikke klasse og koncentration af antimikrobielle forbindelser i G. gracilis variere i overensstemmelse hermed.

G. gracilis har også vist sig at holde antioxidant egenskaber, der indeholder forskellige phenolforbindelser, som har vist sig at skylle frie radikaler og reducere oxidativt stress¹².Antioxidanter hjælper med at beskytte celler mod skader forårsaget af reaktive iltarter og har potentielle sundhedsmæssige fordele. Antioxidantkapaciteten kan evalueres direkte ved hjælp af forskellige metoder, herunder 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) frie radikaler og indirekte gennem kvantificering af det samlede polyfenolindhold (TPC)¹³.

Selv om en ingrediens rapporteres at have en fremtrædende bioaktivitet, er dens cytotoksicitetsvurdering uundværlig ved vurderingen af naturlige og syntetiske stoffer, der skal anvendes i kontakt med levende celler eller væv. Der er flere metoder til måling af cytotoksicitet, hver med fordele og begrænsninger. Samlet set tilbyder de en række muligheder for at evaluere de skadelige virkninger af mange stoffer på celler og samtidig undersøge mekanismerne bag celleskader og død¹⁴.

I dette arbejde bruger vi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, en kolorimetrisk metode introduceret af Mosmann (1983)¹⁵. Denne metode måler reduktionen af tetrazoliumsalte til et lilla formazanprodukt af metabolisk aktive celler. Jo højere mængden af formazankrystaller er, desto højere er antallet af levedygtige celler, hvilket giver et indirekte mål for cytotoksicitet¹⁴. Da G. gracilis vand og ethanolekstrakter i dette arbejde er beregnet til at blive inkorporeret i dermokosmetiske formuleringer, udføres in vitro cytotoksicitetsevalueringen i en keratinocyt (HaCaT) cellelinje.

Med hensyn til fødevareanvendelsen er tang generelt lav i kalorier og ernæringsmæssigt rig på kostfibre, essentielle elementer og aminosyrer, polysaccharider, flerumættede fedtsyrer, polyphenoler og vitaminer ^2,16. G. gracilis er ingen undtagelse, der har en interessant næringsværdi. Freitas et al. (2021)⁴ fandt ud af, at dyrket G. gracilis havde højere niveauer af protein og C-vitamin og opretholdt niveauet af samlede lipider sammenlignet med vild tang. Dette kan udgøre en økonomisk og miljømæssig fordel, da produktion ernæringsmæssigt set er at foretrække frem for udnyttelse af vilde ressourcer. Derudover er forbrugerne i stigende grad bekymrede over den type mad, de spiser, så det er vigtigt at introducere nye ingredienser til fødevareberigelse og bruge nye ressourcer til at opnå ekstrakter, der kan tilføre værdi til et produkt og kræve en “ren etiket”. Desuden er det nuværende marked meget konkurrencepræget og kræver udvikling af nye produkter og innovative strategier for at differentiere producenterne fra deres konkurrenter¹⁷.

Berigelse af produkter med ringe næringsværdi, såsom pasta, med marine ressourcer, herunder tang, er en strategi for at introducere denne ressource som en ny fødevare og en markedsdifferentieringsstrategi gennem et produkt med tydelig næringsværdi. På den anden side er G. gracilis en kilde til naturlige røde pigmenter såsom phycobiliproteiner¹⁸, der har et stort potentiale for anvendelser i fødevareindustrien. Denne tang har vist stor interesse i flere områder, og dens anvendelse kan ske ved hjælp af hele tang, ekstrakter og/eller den resterende biomasse. I dette arbejde demonstrerer vi nogle eksempler på sådanne applikationer.

Protocol

1. Høst og forberedelse af biomasse Høst prøverne af G. gracilis under lavvande og transporter dem hurtigt til laboratoriet i mørke, afkølede kasser for at undgå tørring, lys og lufteksponering. I laboratoriet vaskes hver thallus med rindende havvand og rengøres grundigt for at fjerne snavs, nekrotiske dele, epifytter og andre organismer fra overfladen. Opbevar den vilde biomasse i konstant luftet havvand (31-35 psu) i et klimarum (20 ± 1 °C) med lav bestråling fra dagsly…

Representative Results

Antimikrobiel aktivitet Ved fortolkning af de opnåede resultater skal man huske på, at jo højere hæmningsprocenten er, desto større er ekstraktets effektivitet til at hæmme væksten af den specifikke stamme, og følgelig jo mere interessant er ekstraktet som et antimikrobielt stof. Gennem denne metode kan vi hurtigt identificere, hvilke ekstrakter der har større aktivitet på visse bakteriestammer, og ogs…

Discussion

De antimikrobielle aktivitetstest i et flydende medium bruges til at evaluere effektiviteten af antimikrobielle stoffer mod mikroorganismer suspenderet i et flydende medium og udføres normalt for at bestemme et stofs evne til at hæmme vækst eller dræbe mikroorganismer^35,36,37,38. De anvendes til at vurdere mikroorganismers følsomhed over for antimikrobielle stoffer og udføres i reagensgla…

Materials

Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9