Valorisation de l’algue rouge Gracilaria gracilis par une approche de bioraffinage
Summary
Nous décrivons ici plusieurs protocoles visant à une valorisation intégrée de Gracilaria gracilis : récolte d’espèces sauvages, culture en interne et extraction de principes bioactifs. Les effets antioxydants, antimicrobiens et cytotoxiques des extraits sont évalués, ainsi que l’évaluation nutritionnelle et de la stabilité des aliments enrichis en biomasse et pigments d’algues entières.
Abstract
L’intérêt pour les algues en tant que matière première abondante pour obtenir des ingrédients bioactifs précieux et multicibles ne cesse de croître. Dans ce travail, nous explorons le potentiel de Gracilaria gracilis, une algue rouge comestible cultivée dans le monde entier pour son intérêt commercial en tant que source d’agar et d’autres ingrédients pour des applications cosmétiques, pharmacologiques, alimentaires et animales.
Les conditions de croissance de G. gracilis ont été optimisées par la multiplication végétative et la sporulation tout en manipulant les conditions physico-chimiques pour obtenir un stock de biomasse important. Des méthodologies d’extraction verte à l’éthanol et à l’eau ont été réalisées sur la biomasse d’algues. Le potentiel bioactif des extraits a été évalué à l’aide d’un ensemble de tests in vitro concernant leur cytotoxicité, leurs propriétés antioxydantes et antimicrobiennes. De plus, la biomasse d’algues séchées a été incorporée dans les formulations de pâtes alimentaires pour augmenter la valeur nutritionnelle des aliments. Des pigments extraits de G. gracilis ont également été incorporés dans le yogourt en tant que colorant naturel, et leur stabilité a été évaluée. Les deux produits ont été soumis à l’appréciation d’un panel sensoriel semi-entraîné visant à obtenir la meilleure formulation finale avant d’arriver sur le marché.
Les résultats confirment la polyvalence de G. gracilis , qu’il soit appliqué sous forme de biomasse entière, d’extraits et/ou de pigments. Grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles optimisés, ce travail permet le développement de produits ayant le potentiel de profiter aux marchés de l’alimentation, des cosmétiques et de l’aquaculture, en promouvant la durabilité environnementale et une économie circulaire bleue.
De plus, et conformément à une approche de bioraffinerie, la biomasse résiduelle d’algues sera utilisée comme biostimulant pour la croissance des plantes ou convertie en matériaux carbonés pour être utilisée dans la purification de l’eau des systèmes d’aquaculture internes de MARE-Polytechnic de Leiria, au Portugal.
Introduction
Les algues peuvent être considérées comme une matière première naturelle intéressante dont profitent les secteurs pharmaceutique, alimentaire, alimentaire et environnemental. Ils biosynthétisent une panoplie de molécules, dont beaucoup ne se trouvent pas dans les organismes terrestres, avec des propriétés biologiques pertinentes 1,2. Cependant, des protocoles de culture optimisés pour les algues doivent être mis en place pour assurer un stock de biomasse important.
Les méthodes de culture doivent toujours tenir compte de la nature des thalles d’algues et de leur morphologie générale. Gracilaria gracilis est un taxon clonal, c’est-à-dire que l’organe d’attache produit plusieurs axes végétatifs. La multiplication par fragmentation (reproduction végétative) est ainsi réalisée, car chacun de ces axes est tout à fait capable d’adopter une vie indépendante du thalle principal3. Les taxons clonaux peuvent être intégrés avec succès avec des méthodologies de culture simples et rapides en une seule étape, car de grandes quantités de biomasse sont obtenues en divisant le thalle en petits fragments qui se régénèrent rapidement et se développent en de nouveaux individus génétiquement identiques. Les thalles haplontiques et diplontiques peuvent être utilisés dans ce processus. Bien que le genre présente un cycle de vie triphasique isomorphe haplo-diplonique complexe, la sporulation est rarement nécessaire, sauf lorsque le renouvellement génétique des stocks est nécessaire pour obtenir des cultures améliorées. Dans ce cas, les tétraspores (spores haplontiques formées par méiose) et les carpospores (spores diplontiques formées par mitose) donnent naissance à des thalles macroscopiques qui peuvent ensuite être cultivés et multipliés par reproduction végétative4. Les cycles de croissance sont dictés par les conditions environnementales et l’état physiologique des individus, entre autres facteurs biologiques tels que l’émergence d’épiphytes et l’adhésion d’autres organismes. Par conséquent, l’optimisation des conditions de croissance est cruciale pour assurer une productivité élevée et produire une biomasse de bonne qualité5.
L’extraction des composés bioactifs des algues, y compris G. gracilis, peut être réalisée par diverses méthodes 6,7. Le choix de la méthode d’extraction dépend des composés spécifiques d’intérêt, de l’application cible et des caractéristiques de l’algue. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’extraction par solvant, qui consiste à utiliser des solvants verts, tels que l’eau ou l’éthanol, pour dissoudre et extraire les composés bioactifs de la biomasse d’algues. L’extraction peut être réalisée par macération de manière polyvalente et efficace et peut être utilisée pour une large gamme de composés. Il s’agit d’une méthode simple et largement utilisée qui consiste à faire tremper la biomasse dans un solvant pendant une période prolongée, généralement à température ambiante ou légèrement élevée. Le solvant est agité pour améliorer le processus d’extraction. Après le temps d’extraction souhaité, le solvant est séparé de la matière solide par filtration ou centrifugation.
L’eau est un solvant couramment utilisé dans les applications alimentaires en raison de sa sécurité, de sa disponibilité et de sa compatibilité avec une large gamme de produits alimentaires. L’extraction à l’eau convient aux composés polaires tels que les polysaccharides, les peptides et certains composés phénoliques. Cependant, il peut ne pas extraire efficacement les composés non polaires. L’éthanol est également un solvant largement utilisé dans les applications alimentaires et peut être efficace pour extraire une variété de molécules bioactives, y compris les composés phénoliques, les flavonoïdes et certains pigments. L’éthanol est généralement reconnu comme sûr pour une utilisation dans les aliments et peut être facilement évaporé, laissant derrière lui les composés extraits. Il convient de noter que le choix de la méthode d’extraction doit tenir compte de facteurs tels que l’efficacité, la sélectivité, la rentabilité et l’impact environnemental. L’optimisation des paramètres d’extraction, tels que la concentration en solvant, le temps d’extraction, la température et la pression, est cruciale pour obtenir des rendements optimaux de composés bioactifs de G. gracilis ou d’autres algues.
Il a été constaté que les algues présentent une activité antimicrobienne contre un large éventail de micro-organismes, y compris les bactéries, les champignons et les virus8. Cette activité est attribuée à des composants bioactifs, notamment des composés phénoliques, des polysaccharides, des peptides et des acides gras. Plusieurs études ont démontré leur efficacité contre des agents pathogènes tels que Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. et Pseudomonas aeruginosa, entre autres9. L’activité antimicrobienne des algues est attribuée à la présence de composés bioactifs qui peuvent interférer avec les parois cellulaires microbiennes, les membranes, les enzymes et les voies de signalisation10. Ces composés peuvent perturber la croissance microbienne, inhiber la formation de biofilm et moduler les réponses immunitaires.
Les algues rouges, également connues sous le nom de rhodophytes, sont un groupe d’algues qui peuvent présenter une activité antimicrobienne contre une variété de micro-organismes. Au sein de ce groupe, G. gracilis contient divers composés bioactifs qui peuvent contribuer à son activité antimicrobienne signalée. Bien que les molécules spécifiques puissent varier, les classes communes qui ont été signalées chez G. gracilis et qui peuvent posséder des propriétés antimicrobiennes sont les polysaccharides, les composés phénoliques, les terpénoïdes et les pigments11. Cependant, il est important de noter que la présence et les quantités de ces composants peuvent varier en fonction de facteurs tels que l’emplacement de la collecte des algues, la saisonnalité, l’état physiologique des thalles et les conditions environnementales. Par conséquent, la classe et la concentration spécifiques de composés antimicrobiens chez G. gracilis peuvent varier en conséquence.
Il a également été démontré que G. gracilis possède des propriétés antioxydantes, contenant divers composés phénoliques, dont il a été démontré qu’ils éliminent les radicaux libres et réduisent le stress oxydatif12.Les antioxydants aident à protéger les cellules contre les dommages causés par les espèces réactives de l’oxygène et ont des avantages potentiels pour la santé. La capacité antioxydante peut être évaluée directement par différentes méthodes, y compris l’activité de piégeage des radicaux libres du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et, indirectement, par la quantification de la teneur totale en polyphénols (TPC)13.
Même si l’on rapporte qu’un ingrédient a une bioactivité importante, son évaluation de la cytotoxicité est indispensable pour évaluer les substances naturelles et synthétiques à utiliser en contact avec des cellules ou des tissus vivants. Il existe plusieurs méthodes de mesure de la cytotoxicité, chacune ayant des avantages et des limites. Dans l’ensemble, ils offrent une gamme d’options pour évaluer les effets nocifs de nombreuses substances sur les cellules et, en même temps, pour étudier les mécanismes de l’endommagement et de la mort cellulaires14.
Dans ce travail, nous utilisons le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), une méthode colorimétrique introduite par Mosmann (1983)15. Cette méthode mesure la réduction des sels de tétrazolium en un produit de formazan violet par des cellules métaboliquement actives. Plus la quantité de cristaux de formazan est élevée, plus le nombre de cellules viables est élevé, fournissant ainsi une mesure indirecte de la cytotoxicité14. Étant donné que dans ce travail, l’eau de G. gracilis et les extraits d’éthanol sont destinés à être incorporés dans des formulations dermo-cosmétiques, l’évaluation de la cytotoxicité in vitro est réalisée dans une lignée cellulaire de kératinocytes (HaCaT).
En ce qui concerne l’application alimentaire, les algues sont généralement faibles en calories et nutritionnellement riches en fibres alimentaires, en éléments essentiels et en acides aminés, en polysaccharides, en acides gras polyinsaturés, en polyphénols et en vitamines 2,16. G. gracilis ne fait pas exception, ayant une valeur nutritionnelle intéressante. Freitas et al. (2021)4 ont constaté que le G. gracilis cultivé avait des niveaux plus élevés de protéines et de vitamine C et maintenait le niveau de lipides totaux par rapport aux algues sauvages. Cela peut représenter un avantage économique et environnemental, car nutritionnellement parlant, la production est préférable à l’exploitation des ressources sauvages. De plus, les consommateurs sont de plus en plus préoccupés par le type d’aliments qu’ils consomment, il est donc important d’introduire de nouveaux ingrédients pour l’enrichissement des aliments et d’utiliser de nouvelles ressources pour obtenir des extraits qui peuvent ajouter de la valeur à un produit et revendiquer un « clean label ». En outre, le marché actuel est très concurrentiel, ce qui nécessite le développement de nouveaux produits et de stratégies innovantes pour différencier les fabricants de leurs concurrents17.
L’enrichissement de produits à faible valeur nutritionnelle, tels que les pâtes, avec des ressources marines, y compris les algues, est une stratégie visant à introduire cette ressource en tant que nouvel aliment et une stratégie de différenciation du marché grâce à un produit à valeur nutritionnelle distincte. D’autre part, G. gracilis est une source de pigments rouges naturels tels que les phycobiliprotéines18, ayant un fort potentiel d’applications dans l’industrie alimentaire. Cette algue a montré un grand intérêt dans plusieurs domaines, et son application peut être faite en utilisant l’algue entière, des extraits et/ou la biomasse restante. Dans ce travail, nous montrons quelques exemples de telles applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tests d’activité antimicrobienne en milieu liquide sont utilisés pour évaluer l’efficacité des substances antimicrobiennes contre les micro-organismes en suspension dans un milieu liquide et sont généralement effectués pour déterminer la capacité d’une substance à inhiber la croissance ou à tuer les micro-organismes35,36,37,38. Ils sont utilisés pour évaluer la sensibilit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT) à travers les projets stratégiques accordés au Centre des sciences marines et environnementales MARE-(UIDP/04292/2020 et UIDB/04292/2020) et au laboratoire associé ARNET (LA/P/0069/2020). FCT a également financé les bourses doctorales individuelles accordées à Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) et Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Ce travail a également été soutenu financièrement par le projet HP4A – HEALTHY PASTA FOR ALL (co-promotion n° 039952), cofinancé par le FEDER – Fonds européen de développement régional, dans le cadre du programme Portugal 2020, à travers le programme opérationnel COMPETE 2020 – Compétitivité et internationalisation.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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