Aufwertung der Rotalge Gracilaria gracilis durch einen Bioraffinerieansatz
Summary
Hier beschreiben wir verschiedene Protokolle, die auf eine integrierte Aufwertung von Gracilaria gracilis abzielen: Ernte von Wildarten, Eigenzucht und Extraktion von bioaktiven Inhaltsstoffen. Die antioxidative, antimikrobielle und zytotoxische Wirkung der Extrakte wird ebenso bewertet wie die Nährwert- und Stabilitätsbewertung von Lebensmitteln, die mit ganzer Algenbiomasse und Pigmenten angereichert sind.
Abstract
Das Interesse an Algen als reichlich vorhandener Rohstoff zur Gewinnung wertvoller und zielführender bioaktiver Inhaltsstoffe wächst kontinuierlich. In dieser Arbeit untersuchen wir das Potenzial von Gracilaria gracilis, einer essbaren Rotalge, die weltweit wegen ihres kommerziellen Interesses als Quelle für Agar und andere Inhaltsstoffe für kosmetische, pharmakologische, Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen angebaut wird.
Die Wachstumsbedingungen von G. gracilis wurden durch vegetative Vermehrung und Sporulation optimiert, während die physikalisch-chemischen Bedingungen manipuliert wurden, um einen großen Biomassebestand zu erreichen. Grüne Extraktionsmethoden mit Ethanol und Wasser wurden über die Algenbiomasse durchgeführt. Das bioaktive Potenzial der Extrakte wurde durch eine Reihe von In-vitro-Assays hinsichtlich ihrer Zytotoxizität, ihrer antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften bewertet. Darüber hinaus wurde getrocknete Algenbiomasse in Nudelformulierungen eingearbeitet, um den Nährwert der Lebensmittel zu erhöhen. Aus G. gracilis extrahierte Pigmente wurden auch als natürlicher Farbstoff in Joghurt eingearbeitet und ihre Stabilität bewertet. Beide Produkte wurden einer halbgeschulten sensorischen Jury unterzogen, die darauf abzielt, die beste Endformulierung zu erreichen, bevor sie auf den Markt kommen.
Die Ergebnisse belegen die Vielseitigkeit von G. gracilis , unabhängig davon, ob es als Gesamtbiomasse, Extrakte und/oder Pigmente angewendet wird. Durch die Implementierung mehrerer optimierter Protokolle ermöglicht diese Arbeit die Entwicklung von Produkten mit dem Potenzial, von den Lebensmittel-, Kosmetik- und Aquakulturmärkten zu profitieren und die ökologische Nachhaltigkeit und eine blaue Kreislaufwirtschaft zu fördern.
Darüber hinaus wird die verbleibende Algenbiomasse im Einklang mit einem Bioraffinerieansatz als Biostimulans für das Pflanzenwachstum verwendet oder in Kohlenstoffmaterialien umgewandelt, die bei der Wasseraufbereitung der hauseigenen Aquakultursysteme von MARE-Polytechnic in Leiria, Portugal, verwendet werden.
Introduction
Algen können als interessanter natürlicher Rohstoff angesehen werden, von dem die Pharma-, Lebensmittel-, Futtermittel- und Umweltbranche profitieren kann. Sie biosynthetisieren eine Vielzahl von Molekülen, von denen viele in terrestrischen Organismen nicht vorkommen und relevante biologische Eigenschaften aufweisen 1,2. Es müssen jedoch Algen-optimierte Anbauprotokolle implementiert werden, um einen großen Biomassebestand zu gewährleisten.
Die Anbaumethoden müssen immer die Art der Algen-Thalli und die allgemeine Morphologie berücksichtigen. Gracilaria gracilis ist ein klonales Taxon, d.h. das Bindungsorgan produziert mehrere vegetative Achsen. Die Fortpflanzung durch Fragmentierung (vegetative Fortpflanzung) wird somit erreicht, da jede dieser Achsen vollständig in der Lage ist, ein unabhängiges Leben vom Hauptthallus3 anzunehmen. Klonale Taxa können mit einfachen und schnellen einstufigen Kultivierungsmethoden erfolgreich integriert werden, da große Mengen an Biomasse durch die Spaltung des Thallus in kleine Fragmente gewonnen werden, die sich schnell regenerieren und zu neuen, genetisch identischen Individuen heranwachsen. Dabei können sowohl haplontische als auch diplontische Thalli verwendet werden. Obwohl die Gattung einen komplexen haplo-diplontischen isomorphen triphasischen Lebenszyklus aufweist, ist eine Sporulation nur selten erforderlich, es sei denn, eine genetische Erneuerung der Bestände ist erforderlich, um verbesserte Ernten zu erzielen. In diesem Fall entstehen sowohl Tetrasporen (haplontische Sporen, die durch Meiose gebildet werden) als auch Carposporen (diplontische Sporen, die durch Mitose gebildet werden) makroskopische Thalli, die dann durch vegetative Vermehrung gezüchtet und vermehrt werden können4. Wachstumszyklen werden von den Umweltbedingungen und dem physiologischen Zustand der Individuen bestimmt, neben anderen biologischen Faktoren wie der Entstehung von Epiphyten und der Adhäsion anderer Organismen. Daher ist die Optimierung der Wachstumsbedingungen von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Produktivität zu gewährleisten und Biomasse von guter Qualität zu produzieren5.
Die Extraktion bioaktiver Verbindungen aus Algen, einschließlich G. gracilis, kann durch verschiedene Methoden erreichtwerden 6,7. Die Wahl der Extraktionsmethode hängt von den spezifischen Verbindungen von Interesse, der Zielanwendung und den Eigenschaften der Algen ab. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Lösungsmittelextraktion, bei der grüne Lösungsmittel wie Wasser oder Ethanol verwendet werden, um bioaktive Verbindungen aus der Algenbiomasse aufzulösen und zu extrahieren. Die Extraktion kann durch Mazeration vielseitig und effektiv durchgeführt werden und kann für eine Vielzahl von Verbindungen verwendet werden. Es handelt sich um eine einfache und weit verbreitete Methode, bei der Biomasse über einen längeren Zeitraum in einem Lösungsmittel eingeweicht wird, typischerweise bei Raum- oder leicht erhöhten Temperaturen. Das Lösungsmittel wird gerührt, um den Extraktionsprozess zu verbessern. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird das Lösungsmittel durch Filtration oder Zentrifugation vom Feststoff getrennt.
Wasser ist aufgrund seiner Sicherheit, Verfügbarkeit und Kompatibilität mit einer Vielzahl von Lebensmitteln ein häufig verwendetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen. Die Wasserextraktion eignet sich für polare Verbindungen wie Polysaccharide, Peptide und bestimmte Phenole. Es kann jedoch sein, dass es unpolare Verbindungen nicht effektiv extrahiert. Ethanol ist auch ein weit verbreitetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen und kann für die Extraktion einer Vielzahl von bioaktiven Molekülen, einschließlich phenolischer Verbindungen, Flavonoide und bestimmter Pigmente, wirksam sein. Ethanol ist allgemein als sicher für die Verwendung in Lebensmitteln anerkannt und kann leicht verdampft werden, wobei die extrahierten Verbindungen zurückbleiben. Es ist erwähnenswert, dass bei der Wahl der Extraktionsmethode Faktoren wie Effizienz, Selektivität, Kosteneffizienz und Umweltauswirkungen berücksichtigt werden sollten. Die Optimierung von Extraktionsparametern wie Lösungsmittelkonzentration, Extraktionszeit, Temperatur und Druck ist entscheidend, um optimale Ausbeuten an bioaktiven Verbindungen aus G. gracilis oder anderen Algen zu erzielen.
Es wurde festgestellt, dass Algen eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen, darunter Bakterien, Pilze und Viren8. Diese Aktivität wird bioaktiven Komponenten zugeschrieben, darunter Phenole, Polysaccharide, Peptide und Fettsäuren. Mehrere Studien haben ihre Wirksamkeit gegen Krankheitserreger wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. und Pseudomonas aeruginosa unter anderem nachgewiesen9. Die antimikrobielle Aktivität von Algen wird auf das Vorhandensein bioaktiver Verbindungen zurückgeführt, die mikrobielle Zellwände, Membranen, Enzyme und Signalwege stören können10. Diese Verbindungen können das mikrobielle Wachstum stören, die Bildung von Biofilmen hemmen und die Immunantwort modulieren.
Rote Algen, auch Rhodophyten genannt, sind eine Gruppe von Algen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen können. Innerhalb dieser Gruppe enthält G. gracilis verschiedene bioaktive Verbindungen, die zu seiner berichteten antimikrobiellen Aktivität beitragen können. Während die spezifischen Moleküle variieren können, sind die gemeinsamen Klassen, über die in G. gracilis berichtet wurde und antimikrobielle Eigenschaften besitzen können, Polysaccharide, Phenole, Terpenoide und Pigmente11. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein und die Mengen dieser Komponenten je nach Faktoren wie dem Ort der Algensammlung, der Saisonalität, dem physiologischen Zustand des Thallis und den Umweltbedingungen variieren können. Daher können die spezifische Klasse und Konzentration der antimikrobiellen Verbindungen in G. gracilis entsprechend variieren.
Es wurde auch festgestellt, dass G. gracilis antioxidative Eigenschaften besitzt, die verschiedene phenolische Verbindungen enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren12.Antioxidantien tragen dazu bei, die Zellen vor Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies zu schützen und haben potenzielle gesundheitliche Vorteile. Die antioxidative Kapazität kann direkt durch verschiedene Methoden bewertet werden, einschließlich der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfängeraktivität und indirekt durch die Quantifizierung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC)13.
Auch wenn ein Inhaltsstoff eine ausgeprägte Bioaktivität aufweist, ist seine Zytotoxizitätsbewertung bei der Bewertung natürlicher und synthetischer Substanzen, die in Kontakt mit lebenden Zellen oder Geweben verwendet werden sollen, unerlässlich. Es gibt mehrere Methoden zur Messung der Zytotoxizität, jede mit Vor- und Nachteilen. Insgesamt bieten sie eine Reihe von Möglichkeiten, die schädlichen Auswirkungen vieler Substanzen auf Zellen zu bewerten und gleichzeitig die Mechanismen von Zellschädigung und Zelltod zu untersuchen14.
In dieser Arbeit verwenden wir den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, eine kolorimetrische Methode, die von Mosmann (1983)15 eingeführt wurde. Diese Methode misst die Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu einem violetten Formazanprodukt durch stoffwechselaktive Zellen. Je höher die Menge an Formazankristallen, desto höher ist die Anzahl lebensfähiger Zellen, was ein indirektes Maß für die Zytotoxizität darstellt14. Da in dieser Arbeit G. gracilis-Wasser und Ethanolextrakte in dermokosmetische Formulierungen eingearbeitet werden sollen, wird die in vitro Zytotoxizitätsbewertung in einer Keratinozyten (HaCaT)-Zelllinie durchgeführt.
In Bezug auf die Lebensmittelanwendung sind Algen im Allgemeinen kalorienarm und nährstoffreich an Ballaststoffen, essentiellen Elementen und Aminosäuren, Polysacchariden, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, Polyphenolen und Vitaminen 2,16. G. gracilis ist da keine Ausnahme und hat einen interessanten Nährwert. Freitas et al. (2021)4 fanden heraus, dass kultivierte G. gracilis im Vergleich zu wilden Algen einen höheren Protein- und Vitamin-C-Gehalt aufwies und den Gesamtlipidspiegel beibehielt. Dies kann einen wirtschaftlichen und ökologischen Vorteil darstellen, da die Produktion ernährungsphysiologisch der Ausbeutung wilder Ressourcen vorzuziehen ist. Darüber hinaus sind die Verbraucher zunehmend besorgt über die Art der Lebensmittel, die sie essen, daher ist es wichtig, neue Zutaten für die Anreicherung von Lebensmitteln einzuführen und neue Ressourcen zu verwenden, um Extrakte zu erhalten, die einem Produkt einen Mehrwert verleihen und ein “sauberes Etikett” beanspruchen können. Außerdem ist der derzeitige Markt sehr wettbewerbsintensiv und erfordert die Entwicklung neuer Produkte und innovativer Strategien, um die Hersteller von ihren Mitbewerbern abzuheben17.
Die Anreicherung von Produkten mit geringem Nährwert, wie z. B. Nudeln, mit Meeresressourcen, einschließlich Algen, ist eine Strategie, um diese Ressource als neues Lebensmittel einzuführen, und eine Marktdifferenzierungsstrategie durch ein Produkt mit ausgeprägtem Nährwert. Auf der anderen Seite ist G. gracilis eine Quelle für natürliche rote Pigmente wie Phycobiliproteine18, die ein hohes Potenzial für Anwendungen in der Lebensmittelindustrie haben. Diese Algen haben in mehreren Bereichen großes Interesse gezeigt, und ihre Anwendung kann mit den gesamten Algen, Extrakten und/oder der verbleibenden Biomasse erfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir einige Beispiele für solche Anwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die antimikrobiellen Aktivitätstests in einem flüssigen Medium werden verwendet, um die Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen Mikroorganismen zu bewerten, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, und werden in der Regel durchgeführt, um die Fähigkeit einer Substanz zu bestimmen, das Wachstum zu hemmen oder Mikroorganismen abzutöten35,36,37,38. Sie werden verwendet, um die E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT) im Rahmen der strategischen Projekte unterstützt, die dem MARE-Zentrum für Meeres- und Umweltwissenschaften (UIDP/04292/2020 und UIDB/04292/2020) und dem assoziierten Labor ARNET (LA/P/0069/2020) gewährt wurden. FCT finanzierte auch die individuellen Promotionsstipendien für Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) und Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Diese Arbeit wurde auch durch das Projekt HP4A – GESUNDE PASTA FÜR ALLE (Co-Promotion Nr. 039952) finanziell unterstützt, das vom EFRE – Europäischer Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Programms Portugal 2020 im Rahmen des operationellen Programms COMPETE 2020 – Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung kofinanziert wird.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
