एक बायोरेफाइनरी दृष्टिकोण के माध्यम से लाल समुद्री शैवाल ग्रेसिलेरिया ग्रैसिलिस का वैलोराइजेशन
Summary
यहां, हम ग्रेसिलेरिया ग्रैसिलिस के एक एकीकृत वैलोराइजेशन के उद्देश्य से कई प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं: जंगली प्रजातियों की कटाई, घर में विकास और बायोएक्टिव अवयवों का निष्कर्षण। अर्क के एंटीऑक्सिडेंट, रोगाणुरोधी, और साइटोटोक्सिक प्रभावों का मूल्यांकन किया जाता है, साथ ही पूरे समुद्री शैवाल बायोमास और पिगमेंट से समृद्ध भोजन के पोषण और स्थिरता मूल्यांकन के साथ।
Abstract
मूल्यवान और मल्टीटार्गेट बायोएक्टिव अवयवों को प्राप्त करने के लिए प्रचुर मात्रा में फीडस्टॉक के रूप में समुद्री शैवाल में रुचि लगातार बढ़ रही है। इस काम में, हम ग्रैसिलेरिया ग्रैसिलिस की क्षमता का पता लगाते हैं, जो कॉस्मेटिक, फार्माकोलॉजिकल, भोजन और फ़ीड अनुप्रयोगों के लिए अगर और अन्य अवयवों के स्रोत के रूप में अपने व्यावसायिक हित के लिए दुनिया भर में खेती की जाने वाली एक खाद्य लाल समुद्री शैवाल है।
जी ग्रैसिलिस विकास की स्थिति को वनस्पति प्रसार और स्पोरुलेशन के माध्यम से अनुकूलित किया गया था, जबकि एक बड़े बायोमास स्टॉक को प्राप्त करने के लिए भौतिक रासायनिक स्थितियों में हेरफेर किया गया था। समुद्री शैवाल बायोमास पर इथेनॉल और पानी के साथ ग्रीन निष्कर्षण पद्धतियों का प्रदर्शन किया गया था। अर्क की बायोएक्टिव क्षमता का मूल्यांकन इन विट्रो परख के एक सेट के माध्यम से किया गया था, जो उनके साइटोटॉक्सिसिटी, एंटीऑक्सिडेंट और रोगाणुरोधी गुणों से संबंधित था। इसके अतिरिक्त, सूखे समुद्री शैवाल बायोमास को भोजन के पोषण मूल्य को बढ़ाने के लिए पास्ता योगों में शामिल किया गया था। ग्रैसिलिस से निकाले गए पिगमेंट को भी दही में एक प्राकृतिक रंग के रूप में शामिल किया गया है, और उनकी स्थिरता का मूल्यांकन किया गया था। दोनों उत्पादों को बाजार तक पहुंचने से पहले सबसे अच्छा अंतिम सूत्रीकरण प्राप्त करने के उद्देश्य से एक अर्ध-प्रशिक्षित संवेदी पैनल की सराहना के लिए प्रस्तुत किया गया था।
परिणाम जी ग्रैसिलिस की बहुमुखी प्रतिभा का समर्थन करते हैं चाहे इसे पूरे बायोमास, अर्क और / कई अनुकूलित प्रोटोकॉल को लागू करने के माध्यम से, यह काम खाद्य, कॉस्मेटिक और जलीय कृषि बाजारों को लाभ पहुंचाने की क्षमता वाले उत्पादों के विकास की अनुमति देता है, पर्यावरणीय स्थिरता और एक नीली परिपत्र अर्थव्यवस्था को बढ़ावा देता है।
इसके अलावा, और एक बायोरेफाइनरी दृष्टिकोण के अनुरूप, अवशिष्ट समुद्री शैवाल बायोमास का उपयोग पौधों के विकास के लिए बायोस्टिमुलेंट के रूप में किया जाएगा या पुर्तगाल के लीरिया के घोड़ी-पॉलिटेक्निक के इन-हाउस जलीय कृषि प्रणालियों के जल शोधन में उपयोग किए जाने के लिए कार्बन सामग्री में परिवर्तित किया जाएगा।
Introduction
समुद्री शैवाल को दवा, भोजन, चारा और पर्यावरण क्षेत्रों द्वारा लाभान्वित होने के लिए एक दिलचस्प प्राकृतिक कच्चे माल के रूप में माना जा सकता है। वे अणुओं की एक पैनोपली को जैवसंश्लेषित करते हैं, कई स्थलीय जीवों में नहीं पाए जाते हैं, प्रासंगिक जैविक गुणों 1,2 के साथ। हालांकि, एक बड़े बायोमास स्टॉक को सुनिश्चित करने के लिए समुद्री शैवाल-अनुकूलित खेती प्रोटोकॉल को लागू करने की आवश्यकता है।
खेती के तरीकों को हमेशा समुद्री शैवाल थैली की प्रकृति और समग्र आकृति विज्ञान पर विचार करना चाहिए। ग्रैसिलेरिया ग्रैसिलिस एक क्लोनल टैक्सोन है, जिसका अर्थ है कि लगाव अंग कई वनस्पति अक्षों का उत्पादन करता है। विखंडन (वनस्पति प्रजनन) द्वारा प्रसार इस प्रकार प्राप्त किया जाता है, क्योंकि इनमें से प्रत्येक अक्ष मुख्य थैलस3 से एक स्वतंत्र जीवन को अपनाने में पूरी तरह से सक्षम है। क्लोनल टैक्सा को सरल और तेज़ एक-चरणीय खेती के तरीकों के साथ सफलतापूर्वक एकीकृत किया जा सकता है, क्योंकि थैलस को छोटे टुकड़ों में विभाजित करके बड़ी मात्रा में बायोमास प्राप्त किया जाता है जो जल्दी से पुन: उत्पन्न होते हैं और नए, आनुवंशिक रूप से समान व्यक्तियों में विकसित होते हैं। इस प्रक्रिया में हैप्लॉन्टिक और डाइप्लॉन्टिक थैली दोनों का उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि जीनस एक जटिल हाप्लो-डिप्लॉन्टिक आइसोमॉर्फिक ट्रिफैसिक जीवन चक्र प्रदर्शित करता है, स्पोरुलेशन शायद ही कभी आवश्यक होता है, सिवाय इसके कि जब बेहतर फसलों को प्राप्त करने के लिए स्टॉक के आनुवंशिक नवीकरण की आवश्यकता होती है। इस मामले में, दोनों टेट्रास्पोर्स (अर्धसूत्रीविभाजन द्वारा गठित हैप्लॉन्टिक बीजाणु) और कार्पोस्पोर्स (माइटोसिस द्वारा गठित द्विध्रुवीय बीजाणु) मैक्रोस्कोपिक थैली को जन्म देते हैं जिन्हें तबवनस्पति प्रजनन द्वारा उगाया और प्रचारित किया जा सकता है। विकास चक्र पर्यावरणीय परिस्थितियों और व्यक्तियों की शारीरिक स्थिति से तय होते हैं, अन्य जैविक कारकों जैसे कि एपिफाइट्स के उद्भव और अन्य जीवों के आसंजन। इसलिए, उच्च उत्पादकता सुनिश्चित करने और अच्छी गुणवत्ता वाले बायोमास का उत्पादन करने के लिए बढ़ती परिस्थितियों का अनुकूलन महत्वपूर्ण है5.
जी gracilis सहित समुद्री शैवाल से bioactive यौगिकों के निष्कर्षण, 6,7 विभिन्न तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. निष्कर्षण विधि की पसंद ब्याज के विशिष्ट यौगिकों, लक्ष्य अनुप्रयोग और समुद्री शैवाल की विशेषताओं पर निर्भर करती है। इस अध्ययन में, हमने विलायक निष्कर्षण पर ध्यान केंद्रित किया, जिसमें समुद्री शैवाल बायोमास से बायोएक्टिव यौगिकों को भंग करने और निकालने के लिए पानी या इथेनॉल जैसे हरे सॉल्वैंट्स का उपयोग करना शामिल है। निष्कर्षण एक बहुमुखी और प्रभावी तरीके से मैक्रेशन के माध्यम से किया जा सकता है और यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक सरल और व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जिसमें एक विस्तारित अवधि के लिए विलायक में बायोमास भिगोना शामिल है, आमतौर पर कमरे या थोड़ा ऊंचा तापमान पर। निष्कर्षण प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए विलायक को उभारा जाता है। वांछित निष्कर्षण समय के बाद, विलायक को निस्पंदन या सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ठोस सामग्री से अलग किया जाता है।
पानी खाद्य उत्पादों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ अपनी सुरक्षा, उपलब्धता और संगतता के कारण खाद्य अनुप्रयोगों में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला विलायक है। जल निष्कर्षण ध्रुवीय यौगिकों जैसे पॉलीसेकेराइड, पेप्टाइड्स और कुछ फेनोलिक्स के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह गैर-ध्रुवीय यौगिकों को प्रभावी ढंग से नहीं निकाल सकता है। इथेनॉल भी खाद्य अनुप्रयोगों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला विलायक है और फेनोलिक यौगिकों, फ्लेवोनोइड्स और कुछ पिगमेंट सहित विभिन्न प्रकार के बायोएक्टिव अणुओं को निकालने के लिए प्रभावी हो सकता है। इथेनॉल को आमतौर पर भोजन में उपयोग के लिए सुरक्षित माना जाता है और निकाले गए यौगिकों को पीछे छोड़ते हुए आसानी से वाष्पित किया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि निष्कर्षण विधि की पसंद को दक्षता, चयनात्मकता, लागत-प्रभावशीलता और पर्यावरणीय प्रभाव जैसे कारकों पर विचार करना चाहिए। निष्कर्षण मापदंडों का अनुकूलन, जैसे विलायक एकाग्रता, निष्कर्षण समय, तापमान और दबाव, जी ग्रैसिलिस या अन्य समुद्री शैवाल से बायोएक्टिव यौगिकों की इष्टतम पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
समुद्री शैवाल सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन करने के लिए पाया गया है, जिसमें बैक्टीरिया, कवक और वायरसशामिल हैं। इस गतिविधि को बायोएक्टिव घटकों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जिसमें फेनोलिक्स, पॉलीसेकेराइड, पेप्टाइड्स और फैटी एसिड शामिल हैं। कई अध्ययनों ने रोगजनकों जैसे एस्चेरिचिया कोलाई, स्टैफिलोकोकस ऑरियस, साल्मोनेला एसपी, और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के खिलाफ अपनी प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है, दूसरों के बीच9. समुद्री शैवाल की रोगाणुरोधी गतिविधि माइक्रोएक्टिव यौगिकों है कि माइक्रोबियल सेल की दीवारों, झिल्ली, एंजाइमों, और सिग्नलिंग रास्ते10 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया है. ये यौगिक माइक्रोबियल विकास को बाधित कर सकते हैं, बायोफिल्म गठन को रोक सकते हैं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित कर सकते हैं।
लाल समुद्री शैवाल, जिसे रोडोफाइट्स के रूप में भी जाना जाता है, शैवाल का एक समूह है जो विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित कर सकता है। इस समूह के भीतर, जी ग्रैसिलिस में विभिन्न बायोएक्टिव यौगिक होते हैं जो इसकी रिपोर्ट की गई रोगाणुरोधी गतिविधि में योगदान कर सकते हैं। जबकि विशिष्ट अणु भिन्न हो सकते हैं, सामान्य वर्ग जो जी ग्रैसिलिस में रिपोर्ट किए गए हैं और रोगाणुरोधी गुण हो सकते हैं, वे पॉलीसेकेराइड, फेनोलिक्स, टेरपेनोइड्स और पिगमेंट11 हैं। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन घटकों की उपस्थिति और मात्रा समुद्री शैवाल संग्रह के स्थान, मौसमी, थैली की शारीरिक स्थिति और पर्यावरणीय परिस्थितियों जैसे कारकों के आधार पर भिन्न हो सकती है। इसलिए, जी. ग्रैसिलिस में रोगाणुरोधी यौगिकों का विशिष्ट वर्ग और एकाग्रता तदनुसार भिन्न हो सकती है।
जी gracilis भी एंटीऑक्सीडेंट गुण धारण करने के लिए पाया गया है, विभिन्न phenolic यौगिकों, जो मुक्त कणों परिमार्जन और ऑक्सीडेटिव तनाव12 को कम करने के लिए दिखाया गया है युक्त.एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के कारण कोशिकाओं को नुकसान से बचाने में मदद करते हैं और संभावित स्वास्थ्य लाभ होते हैं। एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का मूल्यांकन सीधे विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें 2,2-डिपेनिल-1-पिक्रिलहाइड्राज़िल (डीपीपीएच) मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि और, अप्रत्यक्ष रूप से, कुल पॉलीफेनोलिक सामग्री (टीपीसी)13के परिमाणीकरण के माध्यम से शामिल हैं।
भले ही एक घटक को एक प्रमुख बायोएक्टिविटी होने की सूचना है, लेकिन जीवित कोशिकाओं या ऊतकों के संपर्क में उपयोग किए जाने वाले प्राकृतिक और सिंथेटिक पदार्थों के मूल्यांकन में इसका साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन अपरिहार्य है। साइटोटॉक्सिसिटी को मापने के लिए कई तरीके हैं, प्रत्येक के फायदे और सीमाएं हैं। कुल मिलाकर, वे कोशिकाओं पर कई पदार्थों के हानिकारक प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए विकल्पों की एक श्रृंखला प्रदान करते हैं और, एक ही समय में, सेल क्षति और मृत्यु14 के तंत्र की जांच करने के लिए.
इस काम में, हम 3- (4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल) -2,5-डिपेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख का उपयोग करते हैं, जो मोसमैन (1983)15द्वारा शुरू की गई एक वर्णमिति विधि है। यह विधि चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं द्वारा बैंगनी फॉर्मज़ान उत्पाद में टेट्राज़ोलियम लवण की कमी को मापती है। फॉर्माज़ान क्रिस्टल की मात्रा जितनी अधिक होगी, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या उतनी ही अधिक होगी, इस प्रकार साइटोटॉक्सिसिटी14 का अप्रत्यक्ष माप प्रदान करेगा। चूंकि इस काम में, जी ग्रैसिलिस पानी और इथेनॉल के अर्क को डर्मो-कॉस्मेटिक योगों में शामिल करने का इरादा है, इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन एक केराटिनोसाइट (HaCaT) सेल लाइन में किया जाता है।
खाद्य आवेदन के संबंध में, समुद्री शैवाल आम तौर पर कैलोरी में कम होते हैं और आहार फाइबर, आवश्यक तत्वों और अमीनो एसिड, पॉलीसेकेराइड, पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड, पॉलीफेनोल और विटामिन 2,16 में पौष्टिक रूप से समृद्ध होते हैं। जी ग्रैसिलिस कोई अपवाद नहीं है, एक दिलचस्प पोषण मूल्य है। फ्रीटास एट अल (2021)4 ने पाया कि खेती की गई जी. ग्रैसिलिस में प्रोटीन और विटामिन सी का उच्च स्तर था और जंगली समुद्री शैवाल की तुलना में कुल लिपिड के स्तर को बनाए रखा। यह एक आर्थिक और पर्यावरणीय लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकता है, क्योंकि पौष्टिक रूप से बोलना, उत्पादन जंगली संसाधनों के शोषण के लिए बेहतर है। इसके अलावा, उपभोक्ता अपने द्वारा खाए जाने वाले भोजन के प्रकार के बारे में चिंतित हैं, इसलिए खाद्य संवर्धन के लिए नई सामग्री पेश करना और अर्क प्राप्त करने के लिए नए संसाधनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो किसी उत्पाद में मूल्य जोड़ सकते हैं और “स्वच्छ लेबल” का दावा कर सकते हैं। इसके अलावा, मौजूदा बाजार बहुत प्रतिस्पर्धी है, नए उत्पादों के विकास और अपने प्रतिद्वंद्वियों17 से निर्माताओं को अलग करने के लिए नवीन रणनीतियों की आवश्यकता है.
समुद्री शैवाल सहित समुद्री संसाधनों के साथ पास्ता, जैसे खराब पोषण मूल्य वाले उत्पादों का संवर्धन, इस संसाधन को एक नए भोजन और विशिष्ट पोषण मूल्य वाले उत्पाद के माध्यम से बाजार भेदभाव रणनीति के रूप में पेश करने की एक रणनीति है। दूसरी ओर, जी ग्रैसिलिस प्राकृतिक लाल पिगमेंट का एक स्रोत है जैसे कि फाइकोबिलिप्रोटीन18, खाद्य उद्योग में अनुप्रयोगों के लिए उच्च क्षमता है। इस समुद्री शैवाल ने कई क्षेत्रों में उच्च रुचि दिखाई है, और इसका उपयोग पूरे समुद्री शैवाल, अर्क और/या शेष बायोमास का उपयोग करके किया जा सकता है। इस काम में, हम ऐसे अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक तरल माध्यम में रोगाणुरोधी गतिविधि परीक्षण एक तरल माध्यम में निलंबित सूक्ष्मजीवों के खिलाफ रोगाणुरोधी पदार्थों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है और आमतौर पर विकास को रोकन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पुर्तगाली फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी (FCT) द्वारा MARE-समुद्री और पर्यावरण विज्ञान केंद्र (UIDP/04292/2020 और UIDB/04292/2020), और एसोसिएट लेबोरेटरी ARNET (LA/P/0069/2020) को दी गई रणनीतिक परियोजनाओं के माध्यम से समर्थित किया गया था। FCT ने मार्टा वी. फ्रीटास (UI/BD/150957/2021) और तातियाना परेरा (2021) को दिए गए व्यक्तिगत डॉक्टरेट अनुदान को भी वित्त पोषित किया। 07791. बीडी)। इस काम को प्रोजेक्ट HP4A – हेल्दी पास्ता फॉर ऑल (सह-प्रचार संख्या 039952) द्वारा भी आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था, जो ERDF द्वारा सह-वित्त पोषित – यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष, पुर्तगाल 2020 कार्यक्रम के तहत, COMPETE 2020 – प्रतिस्पर्धात्मकता और अंतर्राष्ट्रीयकरण परिचालन कार्यक्रम के माध्यम से किया गया था।
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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