Biorefinery 접근 방식을 통한 Red Seaweed Gracilaria gracilis 의 가치 평가
Summary
여기에서는 Gracilaria gracilis의 통합 가치 평가를 목표로 하는 몇 가지 프로토콜에 대해 설명합니다: 야생 종 수확, 자체 성장 및 생체 활성 성분 추출. 추출물의 항산화, 항균 및 세포 독성 효과와 함께 전체 해조류 바이오매스 및 색소가 풍부한 식품의 영양 및 안정성 평가가 평가됩니다.
Abstract
가치 있는 다중 표적 생리활성 성분을 얻기 위한 풍부한 공급 원료로서의 해조류에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있습니다. 이 연구에서 우리는 화장품, 약리학, 식품 및 사료 응용 분야를 위한 한천 및 기타 성분의 공급원으로서 상업적 이익을 위해 전 세계적으로 재배되는 식용 붉은 해초인 Gracilaria gracilis의 잠재력을 탐구합니다.
G. gracilis 성장 조건은 식물 번식 및 포자 형성을 통해 최적화되었으며 물리 화학적 조건을 조작하여 대규모 바이오 매스 스톡을 달성했습니다. 에탄올과 물을 사용한 녹색 추출 방법은 해조류 바이오매스에서 수행되었습니다. 추출물의 생체 활성 잠재력은 세포 독성, 항산화 및 항균 특성에 관한 일련의 시험관 내 분석을 통해 평가되었습니다. 또한 말린 해조류 바이오매스를 파스타 제형에 통합하여 식품의 영양가를 높였습니다. G. gracilis 에서 추출한 색소도 천연 착색제로 요구르트에 배합되어 안정성을 평가했습니다. 두 제품 모두 시장에 출시되기 전에 최상의 최종 제형을 달성하는 것을 목표로 하는 반 훈련된 감각 패널의 평가를 받았습니다.
결과는 G. gracilis가 전체 바이오매스, 추출물 및/또는 안료로 적용되는지 여부에 관계없이 G. gracilis 의 다양성을 뒷받침합니다. 몇 가지 최적화된 프로토콜을 구현함으로써 이 작업을 통해 식품, 화장품 및 양식 시장에 수익을 창출할 수 있는 잠재력을 가진 제품을 개발하고 환경 지속 가능성과 청색 순환 경제를 촉진할 수 있습니다.
또한, 바이오리파이너리 접근법에 따라 잔류 해조류 바이오매스는 식물 성장을 위한 생물 자극제로 사용되거나 포르투갈 레이리아의 MARE-Polytechnic 사내 양식 시스템의 수질 정화에 사용되는 탄소 물질로 전환될 것입니다.
Introduction
해조류는 제약, 식품, 사료 및 환경 부문에서 이익을 얻을 수 있는 흥미로운 천연 원료로 간주될 수 있습니다. 그들은 관련 생물학적 특성을 가진 육상 유기체에서 발견되지 않는 분자의 파노라마를 생합성합니다 1,2. 그러나 대규모 바이오매스 재고를 확보하기 위해서는 해조류에 최적화된 재배 프로토콜을 구현해야 합니다.
재배 방법은 항상 해조류 탈리의 특성과 전반적인 형태를 고려해야 합니다. Gracilaria gracilis 는 클론 분류군으로, 부착 기관이 여러 식물 축을 생산한다는 것을 의미합니다. 따라서 단편화(식물 번식)에 의한 번식이 이루어지는데, 이는 이들 축이 각각 주 시상(primary thallus)3으로부터 독립된 생명을 완전히 채택할 수 있기 때문이다. 클론 분류군은 간단하고 빠른 원스텝 재배 방법론과 성공적으로 통합될 수 있는데, 이는 탈루스를 빠르게 재생하고 유전적으로 동일한 새로운 개체로 성장시키는 작은 조각으로 분할하여 많은 양의 바이오매스를 얻을 수 있기 때문입니다. 이 과정에서 haplontic 및 diplontic thalli가 모두 사용될 수 있습니다. 속은 복잡한 haplo-diplontic isomorphic triphasic 수명주기를 나타내지만, 포자 형성은 개선 된 작물을 달성하기 위해 주식의 유전 적 재생이 필요한 경우를 제외하고는 거의 필요하지 않습니다. 이 경우, tetraspores(감수분열에 의해 형성된 haplontic spores)와 carpospores(유사분열에 의해 형성된 diplontic spores)는 모두 식물 번식에 의해 성장하고 번식될 수 있는 거시적 탈리(thalli)를 발생시킨다4. 성장주기는 환경 조건과 개인의 생리적 상태, 착생 식물의 출현 및 다른 유기체의 접착과 같은 다른 생물학적 요인에 의해 결정됩니다. 따라서 재배 조건을 최적화하는 것은 높은 생산성을 보장하고 양질의 바이오매스를 생산하는 데 매우 중요하다5.
G. gracilis를 포함한 해조류로부터 생리활성 화합물의 추출은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다 6,7. 추출 방법의 선택은 특정 관심 화합물, 대상 응용 분야 및 해조류의 특성에 따라 다릅니다. 이 연구에서 우리는 물이나 에탄올과 같은 녹색 용매를 사용하여 해조류 바이오매스에서 생리 활성 화합물을 용해하고 추출하는 용매 추출에 중점을 두었습니다. 추출은 다양하고 효과적인 방법으로 침용을 통해 수행 할 수 있으며 광범위한 화합물에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 실온 또는 약간 높은 온도에서 장기간 용매에 바이오매스를 담그는 간단하고 널리 사용되는 방법입니다. 용매는 추출 공정을 향상시키기 위해 교반됩니다. 원하는 추출 시간이 지나면 용매를 여과 또는 원심분리를 통해 고체 물질에서 분리합니다.
물은 안전성, 가용성 및 다양한 식품과의 호환성으로 인해 식품 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 용매입니다. 물 추출은 다당류, 펩타이드 및 특정 페놀과 같은 극성 화합물에 적합합니다. 그러나 비극성 화합물을 효과적으로 추출하지 못할 수 있습니다. 에탄올은 또한 식품 응용 분야에서 널리 사용되는 용매이며 페놀 화합물, 플라보노이드 및 특정 안료를 포함한 다양한 생체 활성 분자를 추출하는 데 효과적일 수 있습니다. 에탄올은 일반적으로 식품에 사용하기에 안전한 것으로 알려져 있으며 추출된 화합물을 남기고 쉽게 증발할 수 있습니다. 추출 방법의 선택은 효율성, 선택성, 비용 효율성 및 환경 영향과 같은 요소를 고려해야 한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 용매 농도, 추출 시간, 온도 및 압력과 같은 추출 파라미터의 최적화는 G. gracilis 또는 기타 해조류에서 생리 활성 화합물의 최적 수율을 달성하는 데 매우 중요합니다.
해조류는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 포함한 광범위한 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다8. 이 활성은 페놀, 다당류, 펩타이드 및 지방산을 포함한 생체 활성 성분에 기인합니다. 여러 연구에서 대장균, 황색포도상구균, 살 모넬라 균, 녹농균과 같은 병원균에 대한 효능이 입증되었습니다9. 해조류의 항균 활성은 미생물 세포벽, 세포막, 효소 및 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 생리 활성 화합물의 존재에 기인한다10. 이러한 화합물은 미생물 성장을 방해하고 생물막 형성을 억제하며 면역 반응을 조절할 수 있습니다.
rhodophytes라고도 알려진 붉은 해조류는 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있는 조류 그룹입니다. 이 그룹 내에서 G. gracilis 는 보고된 항균 활성에 기여할 수 있는 다양한 생체 활성 화합물을 함유하고 있습니다. 특정 분자는 다양할 수 있지만, G. gracilis 에서 보고되고 항균 특성을 가질 수 있는 일반적인 부류는 다당류, 페놀, 테르페노이드 및 색소이다11. 그러나 이러한 성분의 존재와 양은 해조류 채취 위치, 계절성, 탈리의 생리적 상태, 환경 조건과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, G. gracilis 에서 항균 화합물의 특정 등급 및 농도는 그에 따라 달라질 수 있습니다.
G. gracilis 는 또한 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 밝혀진 다양한 페놀 화합물을 함유한 항산화 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다12.항산화제는 활성 산소로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 되며 잠재적인 건강상의 이점이 있습니다. 항산화 능력은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 활성산소 제거 활성을 포함한 다양한 방법을 통해 직접 평가할 수 있으며, 간접적으로 총 폴리페놀 함량(TPC)의 정량화를 통해 평가할 수 있습니다13.
성분이 두드러진 생체 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었지만, 세포 독성 평가는 살아있는 세포 또는 조직과 접촉하는 데 사용되는 천연 및 합성 물질을 평가하는 데 필수적입니다. 세포 독성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 각 방법에는 장점과 한계가 있습니다. 전반적으로, 그들은 세포에 대한 많은 물질의 유해한 영향을 평가하고 동시에 세포 손상 및 사멸의 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 옵션을 제공합니다14.
이 연구에서는 Mosmann(1983)15에 의해 도입된 비색 방법인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 사용합니다. 이 방법은 대사 활성 세포에 의한 테트라졸륨 염의 자주색 포르마잔 생성물 환원을 측정합니다. 포르마잔 결정의 양이 많을수록 생존 가능한 세포의 수가 많아 세포 독성의 간접적인 측정을 제공합니다14. 이 연구에서 G. gracilis 물과 에탄올 추출물은 dermo-cosmetic 제형에 통합되도록 의도되었기 때문에 in vitro 세포 독성 평가는 각질 세포(HaCaT) 세포주에서 수행됩니다.
식품 적용과 관련하여 해조류는 일반적으로 칼로리가 낮고 식이 섬유, 필수 요소 및 아미노산, 다당류, 고도 불포화 지방산, 폴리페놀 및 비타민 2,16이 영양적으로 풍부합니다. G. gracilis도 예외는 아니며 흥미로운 영양가를 가지고 있습니다. Freitas et al. (2021)4에 따르면 재배된 G. gracilis는 야생 해조류에 비해 단백질과 비타민 C 수치가 더 높고 총 지질 수준을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이것은 영양학적으로 말하자면 야생 자원의 착취보다 생산이 바람직하기 때문에 경제적, 환경적 이점을 나타낼 수 있습니다. 또한 소비자들은 자신이 먹는 식품의 종류에 대해 점점 더 많은 관심을 가지고 있으므로 식품 농축을 위한 새로운 성분을 도입하고 새로운 자원을 사용하여 제품에 가치를 더하고 “클린 라벨”을 주장할 수 있는 추출물을 얻는 것이 중요합니다. 게다가, 현재 시장은 경쟁이 매우 치열하여 제조업체를 경쟁업체와 차별화하기 위해 신제품 개발과 혁신적인 전략이 필요합니다17.
파스타와 같이 영양가가 낮은 제품에 해조류 등 수산자원을 농축하는 것은 영양가가 뚜렷한 제품을 통해 이를 새로운 식품으로 소개하는 전략이자 시장 차별화 전략이다. 한편, G. gracilis 는 phycobiliproteins18과 같은 천연 적색 색소의 공급원으로, 식품 산업에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 해조류는 여러 분야에서 높은 관심을 보였으며 전체 해조류, 추출물 및/또는 나머지 바이오매스를 사용하여 적용할 수 있습니다. 이 작업에서는 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
액체 배지에서의 항균 활성 시험은 액체 배지에 현탁된 미생물에 대한 항균 물질의 효과를 평가하는 데 사용되며 일반적으로 성장을 억제하거나 미생물을 죽이는 물질의 능력을 결정하기 위해 수행됩니다35,36,37,38. 이들은 항균제에 대한 미생물의 민감도를 평가하는데 사용되며, 시험관 또는 미세적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 MARE-해양 및 환경 과학 센터(UIDP/04292/2020 및 UIDB/04292/2020) 및 Associate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)에 부여된 전략 프로젝트를 통해 포르투갈 과학 기술 재단(FCT)의 지원을 받았습니다. FCT는 또한 Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)와 Tatiana Pereira(2021. 07791. BD)입니다. 이 작업은 또한 COMPETE 2020 – 경쟁력 및 국제화 운영 프로그램을 통해 포르투갈 2020 프로그램에 따라 ERDF(유럽 지역 개발 기금)가 공동 자금을 지원하는 프로젝트 HP4A – HEALTHY PASTA FOR ALL(공동 프로모션 번호 039952)의 재정적 지원을 받았습니다.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
