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방법 논문

Biorefinery 접근 방식을 통한 Red Seaweed Gracilaria gracilis 의 가치 평가

3.8K 조회수

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DOI:

10.3791/65923

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2023년 11월 21일

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1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

이 논문에서

요약

여기에서는 Gracilaria gracilis의 통합 가치 평가를 목표로 하는 몇 가지 프로토콜에 대해 설명합니다: 야생 종 수확, 자체 성장 및 생체 활성 성분 추출. 추출물의 항산화, 항균 및 세포 독성 효과와 함께 전체 해조류 바이오매스 및 색소가 풍부한 식품의 영양 및 안정성 평가가 평가됩니다.

초록

가치 있는 다중 표적 생리활성 성분을 얻기 위한 풍부한 공급 원료로서의 해조류에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있습니다. 이 연구에서 우리는 화장품, 약리학, 식품 및 사료 응용 분야를 위한 한천 및 기타 성분의 공급원으로서 상업적 이익을 위해 전 세계적으로 재배되는 식용 붉은 해초인 Gracilaria gracilis의 잠재력을 탐구합니다.

G. gracilis 성장 조건은 식물 번식 및 포자 형성을 통해 최적화되었으며 물리 화학적 조건을 조작하여 대규모 바이오 매스 스톡을 달성했습니다. 에탄올과 물을 사용한 녹색 추출 방법은 해조류 바이오매스에서 수행되었습니다. 추출물의 생체 활성 잠재력은 세포 독성, 항산화 및 항균 특성에 관한 일련의 시험관 내 분석을 통해 평가되었습니다. 또한 말린 해조류 바이오매스를 파스타 제형에 통합하여 식품의 영양가를 높였습니다. G. gracilis 에서 추출한 색소도 천연 착색제로 요구르트에 배합되어 안정성을 평가했습니다. 두 제품 모두 시장에 출시되기 전에 최상의 최종 제형을 달성하는 것을 목표로 하는 반 훈련된 감각 패널의 평가를 받았습니다.

결과는 G. gracilis가 전체 바이오매스, 추출물 및/또는 안료로 적용되는지 여부에 관계없이 G. gracilis 의 다양성을 뒷받침합니다. 몇 가지 최적화된 프로토콜을 구현함으로써 이 작업을 통해 식품, 화장품 및 양식 시장에 수익을 창출할 수 있는 잠재력을 가진 제품을 개발하고 환경 지속 가능성과 청색 순환 경제를 촉진할 수 있습니다.

또한, 바이오리파이너리 접근법에 따라 잔류 해조류 바이오매스는 식물 성장을 위한 생물 자극제로 사용되거나 포르투갈 레이리아의 MARE-Polytechnic 사내 양식 시스템의 수질 정화에 사용되는 탄소 물질로 전환될 것입니다.

서론

해조류는 제약, 식품, 사료 및 환경 부문에서 이익을 얻을 수 있는 흥미로운 천연 원료로 간주될 수 있습니다. 그들은 관련 생물학적 특성을 가진 육상 유기체에서 발견되지 않는 분자의 파노라마를 생합성합니다 1,2. 그러나 대규모 바이오매스 재고를 확보하기 위해서는 해조류에 최적화된 재배 프로토콜을 구현해야 합니다.

재배 방법은 항상 해조류 탈리의 특성과 전반적인 형태를 고려해야 합니다. Gracilaria gracilis 는 클론 분류군으로, 부착 기관이 여러 식물 축을 생산한다는 것을 의미합니다. 따라서 단편화(식물 번식)에 의한 번식이 이루어지는데, 이는 이들 축이 각각 주 시상(primary thallus)3으로부터 독립된 생명을 완전히 채택할 수 있기 때문이다. 클론 분류군은 간단하고 빠른 원스텝 재배 방법론과 성공적으로 통합될 수 있는데, 이는 탈루스를 빠르게 재생하고 유전적으로 동일한 새로운 개체로 성장시키는 작은 조각으로 분할하여 많은 양의 바이오매스를 얻을 수 있기 때문입니다. 이 과정에서 haplontic 및 diplontic thalli가 모두 사용될 수 있습니다. 속은 복잡한 haplo-diplontic isomorphic triphasic 수명주기를 나타내지만, 포자 형성은 개선 된 작물을 달성하기 위해 주식의 유전 적 재생이 필요한 경우를 제외하고는 거의 필요하지 않습니다. 이 경우, tetraspores(감수분열에 의해 형성된 haplontic spores)와 carpospores(유사분열에 의해 형성된 diplontic spores)는 모두 식물 번식에 의해 성장하고 번식될 수 있는 거시적 탈리(thalli)를 발생시킨다4. 성장주기는 환경 조건과 개인의 생리적 상태, 착생 식물의 출현 및 다른 유기체의 접착과 같은 다른 생물학적 요인에 의해 결정됩니다. 따라서 재배 조건을 최적화하는 것은 높은 생산성을 보장하고 양질의 바이오매스를 생산하는 데 매우 중요하다5.

G. gracilis를 포함한 해조류로부터 생리활성 화합물의 추출은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다 6,7. 추출 방법의 선택은 특정 관심 화합물, 대상 응용 분야 및 해조류의 특성에 따라 다릅니다. 이 연구에서 우리는 물이나 에탄올과 같은 녹색 용매를 사용하여 해조류 바이오매스에서 생리 활성 화합물을 용해하고 추출하는 용매 추출에 중점을 두었습니다. 추출은 다양하고 효과적인 방법으로 침용을 통해 수행 할 수 있으며 광범위한 화합물에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 실온 또는 약간 높은 온도에서 장기간 용매에 바이오매스를 담그는 간단하고 널리 사용되는 방법입니다. 용매는 추출 공정을 향상시키기 위해 교반됩니다. 원하는 추출 시간이 지나면 용매를 여과 또는 원심분리를 통해 고체 물질에서 분리합니다.

물은 안전성, 가용성 및 다양한 식품과의 호환성으로 인해 식품 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 용매입니다. 물 추출은 다당류, 펩타이드 및 특정 페놀과 같은 극성 화합물에 적합합니다. 그러나 비극성 화합물을 효과적으로 추출하지 못할 수 있습니다. 에탄올은 또한 식품 응용 분야에서 널리 사용되는 용매이며 페놀 화합물, 플라보노이드 및 특정 안료를 포함한 다양한 생체 활성 분자를 추출하는 데 효과적일 수 있습니다. 에탄올은 일반적으로 식품에 사용하기에 안전한 것으로 알려져 있으며 추출된 화합물을 남기고 쉽게 증발할 수 있습니다. 추출 방법의 선택은 효율성, 선택성, 비용 효율성 및 환경 영향과 같은 요소를 고려해야 한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 용매 농도, 추출 시간, 온도 및 압력과 같은 추출 파라미터의 최적화는 G. gracilis 또는 기타 해조류에서 생리 활성 화합물의 최적 수율을 달성하는 데 매우 중요합니다.

해조류는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 포함한 광범위한 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다8. 이 활성은 페놀, 다당류, 펩타이드 및 지방산을 포함한 생체 활성 성분에 기인합니다. 여러 연구에서 대장균, 황색포도상구균, 살 모넬라 균, 녹농균과 같은 병원균에 대한 효능이 입증되었습니다9. 해조류의 항균 활성은 미생물 세포벽, 세포막, 효소 및 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 생리 활성 화합물의 존재에 기인한다10. 이러한 화합물은 미생물 성장을 방해하고 생물막 형성을 억제하며 면역 반응을 조절할 수 있습니다.

rhodophytes라고도 알려진 붉은 해조류는 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있는 조류 그룹입니다. 이 그룹 내에서 G. gracilis 는 보고된 항균 활성에 기여할 수 있는 다양한 생체 활성 화합물을 함유하고 있습니다. 특정 분자는 다양할 수 있지만, G. gracilis 에서 보고되고 항균 특성을 가질 수 있는 일반적인 부류는 다당류, 페놀, 테르페노이드 및 색소이다11. 그러나 이러한 성분의 존재와 양은 해조류 채취 위치, 계절성, 탈리의 생리적 상태, 환경 조건과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, G. gracilis 에서 항균 화합물의 특정 등급 및 농도는 그에 따라 달라질 수 있습니다.

G. gracilis 는 또한 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 밝혀진 다양한 페놀 화합물을 함유한 항산화 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다12.항산화제는 활성 산소로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 되며 잠재적인 건강상의 이점이 있습니다. 항산화 능력은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 활성산소 제거 활성을 포함한 다양한 방법을 통해 직접 평가할 수 있으며, 간접적으로 총 폴리페놀 함량(TPC)의 정량화를 통해 평가할 수 있습니다13.

성분이 두드러진 생체 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었지만, 세포 독성 평가는 살아있는 세포 또는 조직과 접촉하는 데 사용되는 천연 및 합성 물질을 평가하는 데 필수적입니다. 세포 독성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 각 방법에는 장점과 한계가 있습니다. 전반적으로, 그들은 세포에 대한 많은 물질의 유해한 영향을 평가하고 동시에 세포 손상 및 사멸의 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 옵션을 제공합니다14.

이 연구에서는 Mosmann(1983)15에 의해 도입된 비색 방법인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 사용합니다. 이 방법은 대사 활성 세포에 의한 테트라졸륨 염의 자주색 포르마잔 생성물 환원을 측정합니다. 포르마잔 결정의 양이 많을수록 생존 가능한 세포의 수가 많아 세포 독성의 간접적인 측정을 제공합니다14. 이 연구에서 G. gracilis 물과 에탄올 추출물은 dermo-cosmetic 제형에 통합되도록 의도되었기 때문에 in vitro 세포 독성 평가는 각질 세포(HaCaT) 세포주에서 수행됩니다.

식품 적용과 관련하여 해조류는 일반적으로 칼로리가 낮고 식이 섬유, 필수 요소 및 아미노산, 다당류, 고도 불포화 지방산, 폴리페놀 및 비타민 2,16이 영양적으로 풍부합니다. G. gracilis도 예외는 아니며 흥미로운 영양가를 가지고 있습니다. Freitas et al. (2021)4에 따르면 재배된 G. gracilis는 야생 해조류에 비해 단백질과 비타민 C 수치가 더 높고 총 지질 수준을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이것은 영양학적으로 말하자면 야생 자원의 착취보다 생산이 바람직하기 때문에 경제적, 환경적 이점을 나타낼 수 있습니다. 또한 소비자들은 자신이 먹는 식품의 종류에 대해 점점 더 많은 관심을 가지고 있으므로 식품 농축을 위한 새로운 성분을 도입하고 새로운 자원을 사용하여 제품에 가치를 더하고 "클린 라벨"을 주장할 수 있는 추출물을 얻는 것이 중요합니다. 게다가, 현재 시장은 경쟁이 매우 치열하여 제조업체를 경쟁업체와 차별화하기 위해 신제품 개발과 혁신적인 전략이 필요합니다17.

파스타와 같이 영양가가 낮은 제품에 해조류 등 수산자원을 농축하는 것은 영양가가 뚜렷한 제품을 통해 이를 새로운 식품으로 소개하는 전략이자 시장 차별화 전략이다. 한편, G. gracilis 는 phycobiliproteins18과 같은 천연 적색 색소의 공급원으로, 식품 산업에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 해조류는 여러 분야에서 높은 관심을 보였으며 전체 해조류, 추출물 및/또는 나머지 바이오매스를 사용하여 적용할 수 있습니다. 이 작업에서는 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여 줍니다.

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프로토콜

1. 바이오매스 수확 및 준비

  1. 썰물 때 G. gracilis 의 표본을 수확하고 건조, 빛 및 공기 노출을 피하기 위해 어둡고 차가운 상자에 담아 실험실로 신속하게 운반합니다.
  2. 실험실에서 흐르는 바닷물로 각 thallus를 씻고 철저히 청소하여 표면에서 파편, 괴사 부위, 착생식물 및 기타 유기체를 제거합니다.
  3. 일광 시원한 백색 및 형광등 및 광주기가 제공하는 낮은 조도, 일광 실내 (31 ± 35 °C)에서 지속적으로 폭기 된 해수 (1-1 psu)에서 야생 바이오 매스를 유지하십시오 (빛 : 어두움) 7 일 동안. 이 기간 동안 영양 배지를 공급하지 마십시오. 이를 통해 해조류는 새로운 실내 조건에 천천히 적응할 수 있습니다.

2. 재고 유지

  1. 적응 기간이 지나면 멸균 칼날로 해초 탈리의 건강한 끝부분을 자릅니다. Redmond et al. (2014)19 에 따라 멸균 상태에서 페트리 접시(1.0% 세균학적 한천, 증류수/해수 비율 1.0%)에서 미리 준비한 한천 겔을 통해 각 팁을 끌어 남아 있는 오염 물질을 제거합니다. 각 팁에 대해 한천 끌기를 세 번 수행하고 항상 한천 겔의 사용하지 않은 부분을 통해 팁을 끕니다.
  2. 염산 용액(HCl, 15%)으로 유리 제품을 산성 세척하고 증류수로 철저히 헹굽니다. 세척 공정에 사용되는 모든 도구, 유리 제품, 한천, 해수 및 증류수를 오토클레이브(121°C, 15분)로 멸균합니다.
    주의 : 공급업체가 제공한 HCl의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
  3. Redmond et al. (2014)19에 따르면 팁은 35psu의 멸균된 해수에서 자라며 붉은 해조류용으로 수정된 Von Stosch 농축 용액(VSE)으로 보충됩니다. 이산화게르마늄(GeO2)을 배지(1mL/L)에 첨가하여 착생 규조류의 성장을 방지합니다.
    주의 : 공급업체에서 제공한 GeO2 의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
    알림: 부분 또는 전체 변색으로 관찰되는 색소 침착 손실을 나타내는 팁은 스트레스를 받고 있거나 이미 죽었으므로 폐기해야 합니다.

3. 재배 및 규모 확대

  1. 순응 기간 후, 20 ± 1 °C로 설정된 기후실에서 20 ± 0.5 μmol 광자 m-2 s-1 (1500 lux)의 백색 시원한 빛, 16 h: 8 h(밝음: 어두움)로 설정된 광주기 및 매주 갱신되는 VSE 배양 배지가 농축된 멸균 해수에서 250mL 평판 바닥 플라스크에 약 8-10개의 건강한 팁을 무작위로 분배합니다.
  2. 매주 체중 측정을 수행하고 탈리에 과도한 부담을 주지 마십시오20. 이를 위해 배양 배지에서 팁을 조심스럽게 제거하고 부드럽게 헹구고 실험실 저울에서 밀리그램의 무게를 잰다.
    참고: 이 절차는 배양 배지 주간 갱신과 함께 수행할 수 있습니다.
  3. 탈리는 이 플라스크에서 최대 2g/L의 밀도까지 자랄 수 있습니다. 이 시점에서 수신자 스케일 업(250mL, 1L 및 5L)을 수행합니다. 부피가 50L에 도달하면 50L 이상의 야외 개방형 흰색 용기로 재배를 옮깁니다.
  4. Patarra et al. (2017)21 에 따라 상대 성장률(RGR)을 계산합니다.
    RGR (% fw/일) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    여기서 IW와 FW는 각각 그램으로 표시되는 초기 및 최종 신선 중량이고 T는 일 단위의 시간입니다.
    알림: 이 실험실 설정에서 RGR은 하루에 최대 21%의 값에 도달합니다. 바이오매스 수확은 언제든지 수행할 수 있습니다. 바이오매스는 용도에 따라 오븐 건조, 동결 건조 또는 단순히 냉동(-20°C)하여 분해를 방지하기 위해 신속하게 처리해야 합니다. 건조된 바이오매스는 실온(RT)에서 보존하거나 냉동 보관할 수도 있습니다.

4. 추출 절차

참고: G. gracils 추출물의 시험관 내 세포 독성, 항산화 및 항균 특성을 평가하기 위해 준비는 추출 온도와 용매 유형이라는 두 가지 매개변수를 고려합니다.

  1. 추출을 수행하려면 G. gracilis 바이오매스를 오븐 건조하고 분말이 200μm 체를 통과할 때까지 바이오매스를 분쇄합니다(예: 가정용 커피 그라인더에서).
  2. 건조된 바이오매스(10g)의 무게를 측정하고 100mL의 용매(절대 에탄올 또는 멸균수)에 녹입니다.
  3. 빛으로부터 보호된 용기에서 30분 동안 저어줍니다.
  4. 실온, 40°C 및 70°C에서 물과 물 > 에탄올 추출을 순차적으로 에탄올 > 수행합니다.
  5. 각 온도에 대해 에탄올과 물을 별도로 두 번 추출합니다.
  6. 여과지(Whatman No.1)를 통한 여과에 의해 잔류 바이오매스에서 액체 추출물을 분리한 후 RT에서 10분 동안 8000 x g 에서 원심분리합니다.
  7. 다른 용매로 추가 추출을 위해 남은 조류 바이오매스를 재사용합니다. 샘플을 먼저 에탄올로 추출한 경우 다음으로 물로 추출하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
  8. 수성 추출물을 동결 건조하고 에탄올 추출물을 40°C의 회전 증발기에서 증발시킵니다.
  9. 건조된 추출물은 4 °C에서 보관합니다.
  10. 추출물을 50mg/mL(항균 분석) 또는 10mg/mL(항산화 분석)의 농도로 용해시킵니다. 수성 추출물을 멸균수에 녹이고 에탄올 추출물을 절대 에탄올에 녹입니다.

5. 항균 작용

참고: 에탄올 및 수성 추출물은 Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), 대장균 (DSM 5922) 및 Listonella anguillarum (DSM 21597)에 대해 개별적으로 테스트해야 합니다. 항균 검사는 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)의 권장 사항에 따라 수행해야 합니다.22. 모든 배양물은 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(DSMZ)에서 얻었습니다. L. 앵귈라룸 은 1% 염화나트륨(NaCl)이 보충된 트립틱 대두 국물(TSB) 또는 트립틱 대두 한천(TSA)에서 성장했습니다. 나머지 2개의 균주는 LB 배지(VWR Chemicals)에서 성장시켰다. Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) 및 Listonella anguillarum (DSM 21597) 배양액은 30°C에서 배양한 반면, Escherichia coli (DSM 5922)는 공급업체의 지침에 따라 37°C에서 배양했습니다. 육수 미세희석법은 액체 배지에서 항균 활성을 측정하는 데 사용할 수 있으며, 이는 미시적 규모로 수행되어야 항균 가능성을 빠르고 효율적으로 결정할 수 있습니다. 이 저비용 방법을 사용하면 단 24시간 만에 결과를 얻을 수 있으므로 초기 단계에서 주어진 미생물 균주에 대해 성장 억제 작용 측면에서 결과를 얻을 수 있는 최상의 추출 조건을 결정하는 데 적합합니다. 그러나 이 방법론은 미생물 성장에 특화된 뚜껑이 있는 멸균 마이크로플레이트를 사용해야 할 뿐만 아니라 600nm 파장을 위한 마이크로플레이트 리더를 사용할 수 있어야 합니다.

  1. 170μL의 Muller-Hinton Broth(MHB)가 포함된 처리되지 않은 둥근 바닥 96웰 마이크로플레이트를 사용하여 10μL의 표준화된 접종물(0.5 McFarland 표준) 및 20μL의 각 추출물(50mg/mL)을 접종하여 육수 미세희석 테스트를 수행합니다.
  2. 각 균주에 대한 최적의 온도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
  3. 0시간 및 24시간에 마이크로플레이트 분광 광도계에 광학 밀도(OD 600)를 기록하여 측정한 가시 탁도를 감소시켜 항균 활성을 감지합니다.
  4. 결과를 억제 백분율로 표현합니다.
    figure-protocol-1
    여기서 Abs. ext는 추출물의 존재 하에서 성장하는 박테리아 균주를 포함하는 웰에서 0 h와 24 h 사이에서 측정된 흡광도의 차이이며, Abs는 박테리아 균주와 용매를 포함하는 웰에서 동일한 측정값을 나타냅니다.
  5. 이 방법에서는 음성 대조군이 될 배양 배지만 포함하는 웰뿐만 아니라 용매(에탄올 또는 물)에 첨가된 표준 균주를 접종한 배지와 박테리아 균주 및 양성 대조군 항생제(클로람페니콜)가 포함된 배지가 있는 웰을 포함하는 대조 반응을 포함합니다.

6. 총 폴리페놀의 항산화 활성 및 정량화

  1. 총 폴리페놀 함량
    참고: 총 폴리페놀 함량(TPC)은 Folin-Ciocalteu 방법23 을 사용하여 수행되며 마이크로 스케일에 맞게 조정됩니다.
    1. 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 158μL의 초순수, 2μL의 시료 및 10μL의 Folin-Ciocalteu 시약을 추가합니다.
      주의: 공급업체가 제공한 Folin-Ciocalteu 시약의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
    2. 2 분 후 30 μL의 Na2CO3 (20 %)를 첨가합니다.
    3. RT의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양한 후 755nm에서 분광광도계로 샘플을 측정합니다.
    4. 갈산(검량선을 표시할 수 있음) 또는 초순수(2μL)를 대조군으로 사용하십시오.
    5. 결과를 갈산당량(mg GAE/g 추출물)으로 표현합니다.
  2. 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성
    참고: 추출물의 항산화 활성은 Duan et al. (2006)24에 기술된 바와 같이 평가되며, 마이크로 스케일에 적합합니다
    1. 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트에 각 샘플 2μL(10mg/mL 농도)와 절대 에탄올(0.1mM)에 용해된 DPPH 198μL를 넣습니다.
      주의 : 공급업체가 제공한 DPPH의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
    2. 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 반응을 실행합니다. 마이크로플레이트 분광 광도계에서 517nm에서 흡광도를 측정합니다.
    3. 2μL의 절대 에탄올/증류수와 198μL의 DPPH 용액으로 제어 반응을 수행합니다. 2μL의 추출물과 198μL의 절대 에탄올로 블랭크 측정을 수행합니다.
    4. 다음 방정식을 사용하여 결과를 DPPH 억제 백분율로 표현합니다.
      figure-protocol-2
      여기서 조류 추출물의 흡광도는 As이고, Ab는 블랭크 샘플의 흡광도이고 Ac는 대조군의 흡광도입니다.

7. 표피세포의 세포독성 평가

참고: G. gracilis의 수성 및 에탄올 추출물의 시험관 내 세포독성 효과는 앞서 설명한 바와 같이 MTT 비색 분석을 통해 인간 각질형성세포(HaCaT 세포 - 300493)에서 평가됩니다25. 세포는 독일 세포주 서비스(Cell Lines Services, Germany, CLS)로부터 획득하였고, 상기 방법은 기관 가이드라인 및 CLS 지침에 따라 수행하였다.
주의 : 공급업체가 제공한 MTT의 안전 데이터 시트 참조)

  1. 세포 배양 유지
    1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제/항진균 용액(암포테리신 B, 0.25mM, 페니실린, 60mM, 스트렙토마이신, 100mM)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's 고포도당 배지(DMEM)에서 HaCaT 세포를 배양합니다.
    2. 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 해리합니다.
      참고: HaCaT 세포의 하위 배양은 세포가 완전히 합류한 후에 이루어집니다.
    3. 37 % CO2 및 5 % 습도의 챔버에서 세포를 배양합니다.
    4. 배양이 80%-85% 합류도에 도달할 때마다 바이오뱅크 지침에 따라 세포를 하위 배양합니다.
  2. 세포독성 평가
    1. 96웰 플레이트에 세포를 파종하고 하룻밤 동안 배양한 후 HaCaT 세포(4 x 104 세포/웰)를 DMSO(100mg/mL)에 미리 용해된 건조된 추출물로 처리합니다. 그런 다음 추출물 용액 2μL를 배지 198μL에 첨가하고 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.
    2. 배양 배지를 제거하고 100μL의 MTT(0.5mg/mL)를 세포에 추가합니다. 위에서 언급한 일반 배양 조건에서 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
    3. MTT 용액을 제거하고 100μL의 DMSO로 세포 내 포르마잔 결정을 용해시킵니다.
    4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다. 결과를 대조군 미처리 세포의 백분율로 표현합니다.

8. 식품 혁신

  1. 새로운 식품: 해초 파스타
    1. 재료 선택과 파스타 배합
      참고: 재료 선택은 파스타 회사와 공동으로 이루어졌습니다. 주요 재료(섹션 8.2에 설명됨)의 선택은 쉬운 접근성과 기존 생산 라인과의 호환성을 고려하여 이루어졌으며, 해양 자원을 사용하여 영양가가 추가된 파스타를 얻었습니다.
      1. 성분을 선택한 후 스프레드시트를 사용하여 제형의 이론적 화학 조성을 분석하여 의도한 영양가(섬유질, 비타민, 미네랄 성분의 공급원, 저포화 지방)에 따라 제형을 설계합니다.
      2. 이론적 요구 사항이 충족되면 8.1.2단계에 설명된 대로 실험실 규모 생산을 진행합니다.
      3. 반 훈련된 패널(>10명의 시음자)과 함께 관능 테스트를 수행하여 다음 단계에 대한 제형의 재형성 또는 수용 여부를 검증합니다.
        참고: 패널은 이전에 파스타 시식을 위해 교육을 받았으며 풍미, 맛, 냄새, 질감 및 모양과 같은 속성과 관련하여 제시된 제형을 쾌락적으로 평가했습니다.
    2. 파스타 생산
      알림: 파스타 압출기를 사용하여 Chifferi 파스타 샘플을 생산합니다.
      1. 장비에서 이전에 정의된 쌀가루, G. gracilis, Chlorella vulgaris를 혼합하고 혼합물에 약 30%의 물을 추가합니다.
      2. 마른 파스타를 얻으려면 Chifferi 를 68°C에서 42분 동안 건조시킨 다음 76°C에서 5시간 30분 동안 건조하여 산업 공정을 시뮬레이션합니다.
      3. 마지막으로, 샘플을 포장 및 진공 밀봉하고 추가 분석이 있을 때까지 RT의 어두운 곳에 보관합니다.
    3. 영양 분석
      알림: 영양 프로필 분석을 위해 건조 및 침용된 샘플을 세 번 사용하십시오.
      1. 조단백질 함량: 8.1.3.2-8.1.3.6단계에 따라 Duarte et al. (2022)26에서 채택한 Kjeldahl 방법을 통해 총 단백질 분석을 수행합니다.
      2. 1.0 g의 샘플(또는 블랭크 분석용 증류수)을 정확하게 칭량하고 분해 튜브에서 Kjeldahl 정제 2개 및 H2SO4 25mL와 혼합합니다.
        주의 : 공급업체가 제공한 H2SO4 의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      3. 220°C의 Kjeldahl 분해기에서 30분 동안 시료를 분해한 후 400°C에서 90분 동안 분해합니다.
      4. RT로 냉각한 후, 증류수 80mL를 첨가하고 형성된 암모니아를 브로모크레졸 그린 및 메틸 레드를 함유하는 4%H3BO3용액 30mL로 증류한다. 이 단계는 알칼리성 조건에서 이루어집니다(Kjeldahl 증류기를 사용하여 40% NaOH로 증류).
        주의: 공급업체가 제공한 브로모크레졸 녹색, 메틸 레드 및 40% NaOH를 함유한 H 3 BO3용액의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      5. 회색빛이 도는 분홍색으로 변하는 것이 관찰될 때까지 HCl 0.1 M으로 증류된 샘플을 적정합니다.
      6. 샘플의 질소 함량으로 표시되는 조단백질 함량을 계산하고 다음 방정식을 사용하여 100g당 g로 표현합니다.
        figure-protocol-3
        여기서VS는 샘플 적정에 사용되는 HCl 부피(mL)에 해당합니다. VB 는 블랭크에 사용된 볼륨에 해당합니다. N은 HCl 정규성에 해당합니다. w는 샘플 중량(g)에 해당합니다.
      7. 총 지방 함량: 8.1.3.8-8.1.3.14단계에 따라 Folch et al. (1957)27에서 채택한 Folch 방법을 사용하여 총 지방 함량을 측정합니다.
      8. CHCl3 와 MeOH를 2:1(v:v)의 비율로 혼합하여 Folch 시약을 준비합니다.
        주의 : 공급 업체가 제공 한 Folch 시약의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      9. 1g의 시료가 포함된 튜브를 시험하려면 Folch 시약 5mL와 증류수 0.8mL를 추가합니다. 소용돌이에서 1분 동안 섞습니다.
      10. 그런 다음 Folch 시약 5mL를 더 넣고 5분 동안 균질화합니다. 0.8% NaCl 용액 1.2mL를 추가하고 2분 동안 균질화합니다.
      11. 샘플을 7000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 친수성 면과 무수 황산나트륨을 통해 유기상(하부상)을 둥근 바닥의 유리 플라스크에 여과합니다.
      12. 시료 손실을 방지하려면 동일한 조건에서 5mL의 CHCl3 첨가, 균질화, 원심분리 및 여과 단계를 반복합니다.
      13. 저압 증발에 의해 수집된 유기상에서 유기 용매를 제거하고 105°C의 오븐에 4시간 동안 그대로 둡니다. 식히십시오ampsamp데시케이터에서.
      14. 다음 방정식을 사용하여 100g당 g로 표현되는 지방 함량을 계산합니다.
        figure-protocol-4
        여기서 W1 은 빈 둥근 바닥 유리 플라스크 무게입니다. W2 는 샘플의 초기 중량입니다. W3 은 샘플 중량이 있는 둥근 바닥 유리 플라스크입니다.
      15. 조섬유 함량: 8.1.3.16-8.1.3.22단계에 따라 ISO 6865(2000)28에서 채택된 방법론을 사용하여 조섬유 함량을 측정합니다.
      16. 샘플 1g(W0)을 필터 바닥(참조 P2)이 있는 유리 도가니에 넣고 섬유 분석기에 넣습니다.
      17. 첫 번째 단계는 산 가수분해입니다: 예열된 1.25%H2SO4150mL 및 소포제(n-옥탄올) 2mL를 각 도가니의 컬럼에 첨가합니다. 끓을 때까지 가열하고 30분 동안 그대로 둡니다.
      18. 이 용매를 제거한 후 탈이온수로 3회 세척하여 염기성 가수분해를 진행한다. 예열된 1.25% NaOH 150mL와 소포제 5mL를 무액 컬럼에 넣고 산 가수분해와 동일한 가열 절차를 수행합니다.
      19. 마지막으로 저온 추출을 위해 150mL의 아세톤으로 삼중 세척합니다.
      20. 이 과정이 끝나면 시스템에서 Crucible을 조심스럽게 제거하고 150°C의 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 최종 무게(W1)를 기록합니다.
      21. 500°C의 머플 퍼니스에 3시간 동안 Crucible을 놓고 최종 중량(W2)을 기록합니다.
      22. 조섬유 함량을 계산하고 다음 방정식을 사용하여 결과를 백분율로 표현합니다.
        %조섬유 = 100 x (W1-W2)/W0
      23. 지방산(FA) 프로필: Fernández et al.(2015)29-8.1.3.24-8.1.3.29단계에 따라 지방산 프로필을 결정합니다.
        참고: 지방산 메틸 에스테르(FAME)는 분쇄된 동결 건조 샘플의 직접 산 촉매 트랜스메틸화에 의해 얻어집니다. 모든 분석은 삼중으로 수행됩니다.
      24. 메탄올에 2 % (v / v) H 2SO4 용액 2mL를 50mg 샘플에 첨가하고 혼합물을 80 °C에서 연속 교반하면서2시간 동안 붓습니다.
        주의 : 공급 업체가 제공 한 메탄올의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      25. RT로 냉각한 후 각 샘플에 초순수 1mL와 n-헵탄 2mL를 넣고 혼합물을 1분 동안 소용돌이치고 5분 동안 원심분리합니다.
        주의 : 공급업체가 제공한 n-헵탄의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      26. FAME이 포함된 상부 n-헵탄상(유기물)을 회수하여 가스 크로마토그래피(GC) 바이알로 옮깁니다.
      27. TR-FAME 모세관 컬럼(60m × 0.25mm ID, 0.25μm 필름 두께), 자동 시료 주입기 및 화염 이온화 검출기(FID)가 장착된 가스 크로마토그래프에서 분석합니다.
      28. 인젝터(비분할 모드)를 250°C로, 검출기를 280°C로 설정합니다. 컬럼의 초기 온도를 75°C로 설정하고 1분 동안 유지합니다. 그런 다음 5°C/min에서 170°C로 올리고 10분 동안 유지합니다. 그런 다음 5°C/min에서 190°C로 올리고 10분 더 유지합니다. 마지막으로 2°C/min에서 240°C로 올리고 10분 동안 유지합니다. 1.5mL/분의 유속으로 헬륨을 운반 가스로 사용합니다. 공기와 수소를 각각 350mL/분 및 35mL/분의 유속으로 공급합니다.
      29. 결과 머무름 시간을 표준물질과 비교하여 FA 프로파일을 결정하고 결과를 총 지방의 백분율로 표현합니다.
      30. 미네랄 원소 프로파일: 8.1.3.31-8.1.3.34단계에 따라 Pinto et al. (2022)30에서 채택한 방법에 따라 ICP-OES로 분석한 미네랄 원소(Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn)를 결정합니다.
      31. 각 건조 시료의 약 0.4g을 정확하게 칭량하고 HNO3 7.5mL와 HCl 2.5mL를 추가합니다.
        주의 : 공급업체가 제공한 HNO3 및 HCl의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
      32. 분해는 2단계 과정을 따릅니다: 30분 안에 온도를 RT에서 90°C로 높인 다음(이 온도에서 30분 더 유지) 105°C에서 60분 동안 가열합니다.
      33. 샘플 용액을 식히고 25mL로 희석한 다음 여과하여 라벨이 부착된 튜브에 보관합니다. 각 분해에서 기준 물질과 블랭크를 사용하여 동일한 공정을 수행합니다. ICP-OES로 다양한 원소의 농도를 구합니다.
      34. 결과를 fw 100g당 mg으로 표현합니다.
      35. 탄수화물 함량: 8.1.3.36-8.1.3.37단계에 따라 탄수화물 함량을 계산합니다.
      36. FAO(Food and Agriculture Organization, FAO; 2003)31에 따라 다음 방정식을 사용하여 100g당 이전에 결정된 계수의 차이로 사용 가능한 탄수화물(섬유질 제외) 함량을 계산합니다
        figure-protocol-5
      37. 결과를 100g당 g로 표현합니다.
      38. 수분 및 회분 함량: 8.1.3.39-8.1.3.45단계에 따라 수분 및 회분 함량을 추정합니다.
      39. 도자기 도가니를 105°C에서 3시간 동안 배양하고 데시케이터에서 식힌 후 무게를 잰다.
      40. 샘플의 10g을 계량하여 도가니에 넣고 연속 중량 값이 10mg 이상 차이가 나지 않을 때까지 3시간 주기 동안 105°C의 건조 오븐에 넣습니다.
      41. 다음 방정식을 사용하여 fw 100g당 g로 표시되는 수분 함량을 계산합니다.
        figure-protocol-6
        여기서 W1 은 빈 샘플팬의 무게이고, W2 는 신선한 샘플이 있는 샘플팬의 무게이고, W3 은 건조된 샘플이 있는 샘플팬의 무게입니다.
      42. 수분 함량 분석 후 건조된 샘플과 함께 샘플팬을 525°C의 소각로에서 4시간 동안 놓습니다.
      43. 연속적인 가중치가 1mg 이상 차이가 나지 않을 때까지 이 절차를 반복합니다.
      44. 샘플을 데시케이터에서 RT로 식힌 다음 무게를 잰다.
      45. 다음 방정식을 사용하여 fw 100g당 g로 표현되는 회분 함량을 계산합니다.
        figure-protocol-7
        여기서 W1 은 빈 샘플팬의 무게, W2 는 신선한 샘플이 있는 샘플팬의 무게, W3 은 무게가 포함된 샘플팬의 무게입니다.
      46. 에너지 값: 8.1.3.47-8.1.3.48단계에 따라 에너지 값을 계산합니다.
      47. EU 규정에 따라 샘플의 에너지 값을 계산합니다.소비자에게 식품 정보 제공(규정 1169/2011)32, 방정식을 사용합니다.
        에너지 (kcal / 100g) = 4 x (g 단백질) + 4 x (g 탄수화물) + 9 x (g 지방) + 2 x (g 섬유질)
        에너지(kJ/100g) = 17 x (단백질 g) + 17 x (g 탄수화물) + 37 x (g 지방) + 8 x (g 섬유질)
      48. 결과를 100g당 킬로칼로리와 100g당 킬로줄로 표현합니다.
    4. 소비자 수용
      1. 증류수에서 8분 동안 조리한 파스타 샘플을 사용하여 소비자 수용도를 평가합니다.
      2. 소비자 수용 테스트 수행: 샘플의 시각적 외관, 색상, 질감, 냄새, 바다 맛, 전반적인 맛, 전반적인 평가 및 구매 의도를 평가합니다.
        참고: 소비자 수용 테스트는 시각적 외관, 색상, 질감, 냄새, 바다 맛, 전반적인 맛, 전반적인 평가 및 구매 의도를 1-9의 척도로 평가하는 쾌락 테스트를 기반으로 하며, 여기서 1은 나쁜 평가, 9는 매우 좋은 평가입니다.
      3. 감각 분석 실험실의 개별 감각 부스에서 감각 테스트를 수행합니다(온도 및 조명 제어 포함). 수저, 냅킨 및 생수가 담긴 유리 컵을 제공하여 샘플 사이의 미각을 청소하십시오.
        참고 : 시음자는 모든 배경에서 16-64 세 (n > 80)입니다.
  2. 요구르트
    1. 색소 추출
      참고: Pereira et al. (2020)18에 설명된 방법론을 통해 색소 추출을 수행합니다.
      1. 추출 용매인 인산나트륨 완충액을 0.1M에서 인산나트륨 이염기성(0.03M) 및 인산나트륨 일염기(0.07M)로 준비합니다. NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 pH 6.8로 설정합니다.
      2. G. gracilis 1g의 무게를 잰 후 인산나트륨 완충액 50mL(pH 6.8)를 추가합니다. 10분 동안 균질화한 다음 모르타르와 유봉으로 10분 동안 침용합니다.
      3. 용액을 튜브로 옮기고 12,298 x g (4°C)에서 20분 동안 원심분리합니다.
      4. 상층액을 모으고 65% 황산암모늄을 천천히 추가합니다. 황산 암모늄이 모두 용해되면 용액을 알루미늄 시트로 덮고 밤새 4 °C에서 침전시킵니다.
        주의 : 공급업체에서 제공한 황산암모늄의 안전보건자료를 참조하십시오.
      5. 침전물을 12,298 x g (4 °C)에서 20분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 회수하여 증류수(약 5mL)에 녹입니다.
      6. 튜브막(14kDa)을 사용하여 물에 대해 24시간 동안 추출물을 투석한 후 동결 건조합니다. 동결 건조된 추출물을 사용할 때까지 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
    2. 요구르트 준비
      1. 저온살균 우유 1L, 천연 요구르트 120g, 설탕 20g, 분유 50g을 열혼합기에 넣고 50°C, 속도 3에서 5분 동안 천연 요구르트를 준비합니다.
      2. 혼합물을 37°C의 인큐베이터에 있는 열혼합기 용기에 넣고 12시간 동안 넣습니다.
      3. 추출물을 0.21% 농도의 요구르트에 혼합하여 혼합합니다. 분석이 완료될 때까지 4°C의 개별 유리 플라스크에 시료를 보관합니다.
      4. 분석할 때까지 색소 없음(대조군)의 요구르트의 개별 부분을 4°C에서 보관합니다.
    3. 색상 안정성
      참고: 12일 동안 색상 분석을 통해 요구르트의 색소 안정성을 평가합니다. 반사율 색도계, 2도 표준 관찰자 및 D65 광원을 사용하여 색상 분석을 수행합니다. 결과는 L(밝기, 검은색 - 흰색, 0 - 100), a*(녹색 - 빨간색, -60 - 60) 및 b*(파란색 - 노란색, -60 - 60) 매개 변수를 사용하여 CIELab 좌표로 표시됩니다. 파라미터 a*는 붉은색의 경우 양수 값이고 녹색의 경우 음수 값을 갖습니다. 매개 변수 b*는 노란색에 대해 양수 값을 취하고 푸르스름한 색상에 대해 음수 값을 사용합니다. L*은 광도의 매개변수로, 각 색상이 흑백33 사이의 그레이스케일 구성원과 동등한 것으로 간주될 수 있는 속성입니다.
      1. 제조업체에서 제공한 흰색 세라믹 플레이트(L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33)를 사용하여 색도계를 보정합니다.
      2. 약 28g의 샘플(또는 대조군)로 셀을 채우고 색상 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 색상을 분석합니다.
        참고: 색상 데이터 분석에 사용된 소프트웨어는 SpectraMagic NX였습니다.
      3. s에서 판독을 5회 수행ample/대조군 삼중.
    4. 감각 분석
      참고: 삼각형 테스트(ISO 4120, 2004)34 와 색상, 맛 및 전반적인 감상에 대한 쾌락적 평가를 사용하여 색소가 포함된 요구르트의 감각 평가를 수행합니다.
      1. 삼각형 테스트의 경우 패널리스트에게 3개의 샘플(색소가 있는 요구르트 샘플 1개와 대조군 샘플 2개 또는 색소가 포함된 요구르트 샘플 2개와 대조군 1개)을 제공하고 향, 질감 및 맛에 따라 다른 샘플을 선택하도록 요청합니다. 임의의 3자리 코드로 식별된 유사한 부피의 샘플을 제공합니다.
      2. 색소가 함유된 요거트의 쾌락적 평가를 위해 패널리스트에게 색소가 함유된 요구르트 샘플을 제공하고 9점 쾌락 척도(매우 싫어함에서 매우 좋아함까지)를 사용하여 색상, 맛 및 전반적인 감상을 평가하도록 요청합니다.

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결과

항균 작용

얻은 결과를 해석 할 때, 억제 비율이 높을수록 특정 균주의 성장을 억제하는 추출물의 효능이 커지고 결과적으로 추출물이 항균제로서 더 흥미로워진다는 점을 명심해야합니다. 이 방법론을 통해 특정 박테리아 균주에서 어떤 추출물이 더 큰 활성을 보이는지 신속하게 식별할 수 있으며, 향후 사용 측면에서 가장 흥미로운 추출물도 식별할 수 있습니다. 따라서 우리는 동일한 추출물에 대한 추가 연구를 위한 출발점을 가질 수 있습니다.

그림 1은 바이오매스 건조 직후(그림 1A)와 에탄올 추출 후 얻은 세 번째 및 네 번째 추출(그림 1B

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토론

액체 배지에서의 항균 활성 시험은 액체 배지에 현탁된 미생물에 대한 항균 물질의 효과를 평가하는 데 사용되며 일반적으로 성장을 억제하거나 미생물을 죽이는 물질의 능력을 결정하기 위해 수행됩니다35,36,37,38. 이들은 항균제에 대한 미생물의 민감도를 평가하는데 사용되며, 시험관 또는 미세적정판에서 수행되며, 여기서 항균 물질의 상이한 농도가 표적 미생물22의 표준화된 현탁액에 대해 시험된다. 항균 활성은 적절한 배양 기간 후 배양 배지에서 미생물 성장 또는 탁도의 유무를 측정하여 평가됩니다.

이러한 테스트를 수행하는 방법에는 육수 희석법, 한천 확산법(예: 디스크 확산 검사) 및 가장 많이 사용되는 육수 미...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 MARE-해양 및 환경 과학 센터(UIDP/04292/2020 및 UIDB/04292/2020) 및 Associate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)에 부여된 전략 프로젝트를 통해 포르투갈 과학 기술 재단(FCT)의 지원을 받았습니다. FCT는 또한 Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)와 Tatiana Pereira(2021. 07791. BD)입니다. 이 작업은 또한 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화 운영 프로그램을 통해 포르투갈 2020 프로그램에 따라 ERDF(유럽 지역 개발 기금)가 공동 자금을 지원하는 프로젝트 HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL(공동 프로모션 번호 039952)의 재정적 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올Aga, 포르투갈64-17-5
염화 암모늄PanReac12125-02-9
Amphotericin BSigma-Aldrich1397-89-3
분석 스케일 저울Sartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii< / em>독일 미생물 컬렉션 및 Cell Cultures (DSMZ)DSM 347
BiotinPanreac AppliChem58-85-5
CentrifugeEppendorf, 5810R5811JH490481
ChloramphenicolPanReac56-75-7
CO2 챔버MemmertN/A
쿨 화이트 형광램프OSRAM Lumilux SkywhiteN/A
농도계 McFarlandGrant InstrumentsN/A
DMEM 매체Sigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Germany1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
에탄올 96%AGA-포르투갈64-17-5
에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 이수화물(Na2EDTA)J.T.Baker6381-92-6
소 태아 혈청(FBS)시그마-알드리치F7524
여과지(Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
플라스크VWR International, Alcabideche, 포르투갈 N/A
Folin-CiocalteuVWR Chemicals31360.264
갈산 Merck149-91-7
게르마늄(IV) 산화물, 99.999%AlfaAesar1310-53-8
HaCaT 세포 – 300493CLS-Cell Lines Services, 독일 
핫 플레이트 마그네틱 스티러IKA, C-MAG HS706.090564
황산철VWR Chemicals10124-49-9
층류 후드TelStar, Portugal526013
LB Medium VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarum독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(DSMZ)  DSM 21597
염화망간VWR 화학물질7773.01.5
마이크로피펫 에펜도르프, 포르투갈N/A
마이크로플레이트VWR International, 알카비데체, 포르투갈 10861-666
마이크로플레이트: Greiner738-0168
마이크로플레이트(멸균)Fisher Scientific10022403
마이크로플레이트 리더  Epoch Microplate 분광 광도계, BioTek, Vermont, USA1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)VWR Chemicals90004-658
오븐바인더, FD11512-04490
오븐바인더, BD11504-62615
페니실린시그마-알드리치1406-05-9
pH 측정기 Inolab  VWR International, 포르투갈 알카비데체 
Pippete 팁포르투갈 에펜도르프5412307
Pyrex 병 미디어 스토리지  VWR International, 포르투갈 알카비데체 16157-169
회전 증발기Heidolph, Laborota 400080409287
RotavaporIKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal07.524254
탄산나트륨 (Na2CO3)Chem-Lab497-19-8
염화나트륨 (NaCl) Normax Chem7647-14-5
나트륨 인산염 이염기성Riedel-de Haë n7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta, 일본색상 데이터 분석 소프트웨어
분광 광도계Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA5A4T092004
스트렙토마이신시그마-알드리치57-92-1
티아민Panreac AppliChem59-43-8
트립신-EDTASigma-AldrichT4049
트립틱 소이 한천 (TSA)VWR 화학물질ICNA091010617
트립틱 소이 브로스 (TSB) VWR Chemicals22091
초순수 Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, 다름슈타트, 독일F5HA17360B
진공 펌프Buchi, 스위스FIS05-402-103
비타민 B12Merck68-19-9
DSM592230049315212099

참고문헌

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