Valorisering av den röda tången Gracilaria gracilis genom en bioraffinaderimetod
Summary
Här beskriver vi flera protokoll som syftar till en integrerad valorisering av Gracilaria gracilis: skörd av vilda arter, intern tillväxt och extraktion av bioaktiva ingredienser. Extraktens antioxidativa, antimikrobiella och cytotoxiska effekter utvärderas, tillsammans med närings- och stabilitetsbedömningen av livsmedel berikade med biomassa och pigment från hela alger.
Abstract
Intresset för tång som en riklig råvara för att få fram värdefulla bioaktiva ingredienser med flera mål ökar kontinuerligt. I detta arbete utforskar vi potentialen hos Gracilaria gracilis, en ätbar röd tång som odlas över hela världen för sitt kommersiella intresse som en källa till agar och andra ingredienser för kosmetiska, farmakologiska, livsmedels- och foderapplikationer.
G. gracilis tillväxtbetingelser optimerades genom vegetativ förökning och sporulering samtidigt som de fysikalisk-kemiska förhållandena manipulerades för att uppnå ett stort biomassalager. Gröna extraktionsmetoder med etanol och vatten utfördes över tångbiomassan. Den bioaktiva potentialen hos extrakt bedömdes genom en uppsättning in vitro-analyser avseende deras cytotoxicitet, antioxidant och antimikrobiella egenskaper. Dessutom inkorporerades torkad tångbiomassa i pastaformuleringar för att öka matens näringsvärde. Pigment extraherade från G. gracilis har också införlivats i yoghurt som ett naturligt färgämne, och deras stabilitet utvärderades. Båda produkterna utvärderades av en semi-utbildad sensorisk panel som syftade till att uppnå den bästa slutliga formuleringen innan den nådde marknaden.
Resultaten stöder mångsidigheten hos G. gracilis oavsett om den appliceras som en hel biomassa, extrakt och/eller pigment. Genom att implementera flera optimerade protokoll möjliggör detta arbete utveckling av produkter med potential att tjäna pengar på livsmedels-, kosmetika- och vattenbruksmarknaderna, vilket främjar miljömässig hållbarhet och en blå cirkulär ekonomi.
Dessutom, och i linje med en bioraffinaderistrategi, kommer den kvarvarande tångbiomassan att användas som biostimulant för växttillväxt eller omvandlas till kolmaterial som ska användas vid vattenrening av de interna vattenbrukssystemen vid MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.
Introduction
Tång kan betraktas som en intressant naturlig råvara som kan utnyttjas av läkemedels-, livsmedels-, foder- och miljösektorerna. De biosyntetiserar en mängd molekyler, många som inte finns i landlevande organismer, med relevanta biologiska egenskaper 1,2. Tångoptimerade odlingsprotokoll måste dock implementeras för att säkerställa ett stort biomassalager.
Odlingsmetoderna måste alltid ta hänsyn till tångens talli och den övergripande morfologin. Gracilaria gracilis är ett klonalt taxon, vilket innebär att fästorganet producerar flera vegetativa axlar. Förökning genom fragmentering (vegetativ reproduktion) uppnås således, eftersom var och en av dessa axlar är fullt kapabla att anta ett självständigt liv från huvudtallus3. Klonala taxa kan framgångsrikt integreras med enkla och snabba enstegsodlingsmetoder, eftersom stora mängder biomassa erhålls genom att dela tallus i små fragment som snabbt regenereras och växer till nya, genetiskt identiska individer. Både haplontisk och diplontisk talli kan användas i denna process. Även om släktet uppvisar en komplex haplo-diplontisk isomorf trifasisk livscykel är sporulering sällan nödvändig utom när genetisk förnyelse av bestånden krävs för att uppnå förbättrade grödor. I detta fall ger både tetrasporer (haplontiska sporer som bildas av meios) och karposporer (diplontiska sporer som bildas av mitos) upphov till makroskopiska talli som sedan kan odlas och förökas genom vegetativ reproduktion4. Tillväxtcykler dikteras av miljöförhållanden och individernas fysiologiska tillstånd, bland andra biologiska faktorer som uppkomsten av epifyter och vidhäftning av andra organismer. Därför är det viktigt att optimera odlingsförhållandena för att säkerställa hög produktivitet och producera biomassa av god kvalitet5.
Extraktion av bioaktiva föreningar från alger, inklusive G. gracilis, kan uppnås genom olika metoder 6,7. Valet av extraktionsmetod beror på de specifika föreningarna av intresse, målapplikationen och tångens egenskaper. I den här studien fokuserade vi på lösningsmedelsextraktion, vilket innebär att man använder gröna lösningsmedel, såsom vatten eller etanol, för att lösa upp och extrahera bioaktiva föreningar från tångbiomassan. Extraktionen kan utföras genom maceration på ett mångsidigt och effektivt sätt och kan användas för ett brett spektrum av föreningar. Det är en enkel och allmänt använd metod som innebär att biomassa blötläggs i ett lösningsmedel under en längre period, vanligtvis vid rumstemperatur eller lätt förhöjda temperaturer. Lösningsmedlet rörs om för att förbättra extraktionsprocessen. Efter önskad extraktionstid separeras lösningsmedlet från det fasta materialet genom filtrering eller centrifugering.
Vatten är ett vanligt lösningsmedel i livsmedelsapplikationer på grund av dess säkerhet, tillgänglighet och kompatibilitet med ett brett utbud av livsmedelsprodukter. Vattenextraktion är lämplig för polära föreningar som polysackarider, peptider och vissa fenoler. Det kan dock inte effektivt extrahera opolära föreningar. Etanol är också ett allmänt använt lösningsmedel i livsmedelsapplikationer och kan vara effektivt för att extrahera en mängd olika bioaktiva molekyler, inklusive fenolföreningar, flavonoider och vissa pigment. Etanol är allmänt erkänt som säkert att använda i livsmedel och kan lätt avdunstas och lämna kvar de extraherade föreningarna. Det är värt att notera att valet av extraktionsmetod bör ta hänsyn till faktorer som effektivitet, selektivitet, kostnadseffektivitet och miljöpåverkan. Optimeringen av extraktionsparametrar, såsom lösningsmedelskoncentration, extraktionstid, temperatur och tryck, är avgörande för att uppnå optimalt utbyte av bioaktiva föreningar från G. gracilis eller andra alger.
Tång har visat sig uppvisa antimikrobiell aktivitet mot ett brett spektrum av mikroorganismer, inklusive bakterier, svampar och virus8. Denna aktivitet tillskrivs bioaktiva komponenter, inklusive fenoler, polysackarider, peptider och fettsyror. Flera studier har visat deras effektivitet mot patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. och Pseudomonas aeruginosa, bland andra9. Den antimikrobiella aktiviteten hos alger tillskrivs närvaron av bioaktiva föreningar som kan störa mikrobiella cellväggar, membran, enzymer och signalvägar10. Dessa föreningar kan störa mikrobiell tillväxt, hämma biofilmbildning och modulera immunsvar.
Röda alger, även kända som rhodofyter, är en grupp alger som kan uppvisa antimikrobiell aktivitet mot en mängd olika mikroorganismer. Inom denna grupp innehåller G. gracilis olika bioaktiva föreningar som kan bidra till dess rapporterade antimikrobiella aktivitet. Även om de specifika molekylerna kan variera, är de vanliga klasserna som har rapporterats i G. gracilis och som kan ha antimikrobiella egenskaper polysackarider, fenoler, terpenoider och pigment11. Det är dock viktigt att notera att förekomsten och mängden av dessa komponenter kan variera beroende på faktorer som platsen för tånginsamlingen, säsongsvariationer, thallis fysiologiska tillstånd och miljöförhållanden. Därför kan den specifika klassen och koncentrationen av antimikrobiella föreningar i G. gracilis variera i enlighet med detta.
G. gracilis har också visat sig ha antioxidativa egenskaper, som innehåller olika fenolföreningar, som har visat sig rensa bort fria radikaler och minska oxidativ stress12.Antioxidanter hjälper till att skydda cellerna från skador orsakade av reaktiva syrearter och har potentiella hälsofördelar. Antioxidanternas kapacitet kan utvärderas direkt genom olika metoder, inklusive 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) friradikaler och, indirekt, genom kvantifiering av totalt polyfenolinnehåll (TPC)13.
Även om en ingrediens rapporteras ha en framträdande bioaktivitet är dess cytotoxicitetsbedömning oumbärlig för att utvärdera naturliga och syntetiska ämnen som ska användas i kontakt med levande celler eller vävnader. Det finns flera metoder för att mäta cytotoxicitet, var och en med fördelar och begränsningar. Sammantaget erbjuder de en rad alternativ för att utvärdera de skadliga effekterna av många ämnen på celler och samtidigt undersöka mekanismerna för cellskador och celldöd14.
I detta arbete använder vi 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys, en kolorimetrisk metod introducerad av Mosmann (1983)15. Denna metod mäter reduktionen av tetrazoliumsalter till en lila formazanprodukt av metaboliskt aktiva celler. Ju högre mängd formazankristaller, desto högre antal livsdugliga celler, vilket ger ett indirekt mått på cytotoxicitet14. Eftersom G. gracilis vatten- och etanolextrakt i detta arbete är avsedda att införlivas i dermokosmetiska formuleringar, utförs cytotoxicitetsutvärderingen in vitro i en keratinocytcellinje (HaCaT).
När det gäller livsmedelsapplikationen är alger i allmänhet kalorisnåla och näringsrika på kostfibrer, essentiella element och aminosyror, polysackarider, fleromättade fettsyror, polyfenoler och vitaminer 2,16. G. gracilis är inget undantag och har ett intressant näringsvärde. Freitas et al. (2021)4 fann att odlad G. gracilis hade högre nivåer av protein och C-vitamin och bibehöll nivån av totala lipider jämfört med vild tång. Detta kan utgöra en ekonomisk och miljömässig fördel, eftersom produktion ur näringssynpunkt är att föredra framför utnyttjande av vilda resurser. Dessutom är konsumenterna alltmer oroade över vilken typ av mat de äter, så det är viktigt att introducera nya ingredienser för livsmedelsberikning och använda nya resurser för att få extrakt som kan ge mervärde till en produkt och göra anspråk på en “clean label”. Dessutom är den nuvarande marknaden mycket konkurrensutsatt, vilket kräver utveckling av nya produkter och innovativa strategier för att skilja tillverkarna från konkurrenterna17.
Berikning av produkter med lågt näringsvärde, t.ex. pasta, med marina resurser, inklusive tång, är en strategi för att introducera denna resurs som ett nytt livsmedel och en strategi för marknadsdifferentiering genom en produkt med ett distinkt näringsvärde. Å andra sidan är G. gracilis en källa till naturliga röda pigment som fykobiliproteiner18, med hög potential för tillämpningar inom livsmedelsindustrin. Denna tång har visat stort intresse inom flera områden, och dess applicering kan göras med hjälp av hela tången, extrakt och/eller den återstående biomassan. I detta arbete visar vi några exempel på sådana tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Testerna av antimikrobiell aktivitet i flytande medium används för att utvärdera de antimikrobiella ämnenas effektivitet mot mikroorganismer suspenderade i flytande medium och utförs vanligtvis för att fastställa ett ämnes förmåga att hämma tillväxt eller döda mikroorganismer35,36,37,38. De används för att utvärdera mikroorganismers känslighet för antimikrobiella medel och utf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT) genom de strategiska projekt som beviljats MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 och UIDB/04292/2020) och Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT finansierade också de individuella doktorandstipendierna till Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) och Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Detta arbete fick också ekonomiskt stöd genom projektet HP4A – HÄLSOSAM PASTA FÖR ALLA (sammarknadsföring nr 039952), som medfinansierades av Eruf – Europeiska regionala utvecklingsfonden, inom ramen för Portugal 2020-programmet, genom det operativa programmet COMPETE 2020 – konkurrenskraft och internationalisering.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
