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방법 논문

H형 고혈압을 가진 쥐에서 Huotan Jiedu Tongluo 달인의 항고혈압 효과 및 메커니즘

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/65932

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2024년 5월 17일

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1Changchun University of Chinese Medicine, 2First Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

여기에서는 H형 고혈압을 유도하기 위한 프로토콜을 제시하고 위내 투여 Huotan Jiedu Tongluo 달인(HTJDTLD)의 항고혈압 효과를 평가합니다. H형 고혈압이 있는 쥐에서 HTJDTLD는 효과적인 항고혈압 효과를 보였는데, 이는 소포체(ER) 스트레스 유발 세포자멸사 경로 활성화 억제와 관련이 있을 수 있습니다.

초록

혈장 호모시스테인(Hcy) 수치 상승을 특징으로 하는 특정 형태의 고혈압인 H형 고혈압은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제가 되었습니다. 이 연구는 혈관 협착증 치료에 일반적으로 사용되는 매우 효과적인 중국 전통 의학 공식인 Huotan Jiedu Tongluo 달인(HTJDTLD)의 저혈압 효과와 기저 기전을 조사했습니다. 쥐에서 H형 고혈압을 유발하기 위해 메티오닌을 사용하였고, HTJDTLD를 위내로 투여하였다. 그런 다음, 쥐의 꼬리 동맥의 수축기 및 이완기 혈압을 비침습적 쥐 꼬리 압력계로 측정했습니다. 대동맥의 조직학적 평가는 hematoxylin-eosin(HE) 염색에 의해 수행되었습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 Hcy 수준을 측정하고, 정량적 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 포도당 조절 단백질 78(GRP78), 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자 2(TRAF2), c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 및 카스파제-3의 mRNA 및 단백질 수준을 측정했습니다. 그 결과, HTJDTLD는 메티오닌 치료 후 혈압을 유의하게 낮추고, 조직병리학적 병변을 완화하며, Hcy 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 또한, HTJDTLD는 주로 소포체(ER) 스트레스 유발 세포사멸 경로에 관여하는 GRP78, JNK, TRAF2 및 caspase 3의 유전자 및 단백질 발현을 유의하게 억제했습니다. 전반적으로, 결과는 HTJDTLD가 H형 고혈압이 있는 쥐에서 효과적인 항고혈압 효과를 나타냈으며, ER 스트레스 유발 세포자멸사 경로 활성화 억제와 관련된 항고혈압 기전을 밝혔다.

서론

심장마비, 뇌졸중, 신부전의 주요 위험 요인인 고혈압은 전 세계 10억 명의 사람들에게 영향을 미치는 중요한 공중 보건 문제가 되었습니다1. 호모시스테인(Hcy)은 티올기 함유 아미노산으로 메티오닌 대사의 중요한 대사 중개자입니다. 혈장 Hcy 수치가 상승된 고혈압은 H형 고혈압으로 정의되며, 이는 뇌졸중 2,3과 같은 심뇌혈관 질환의 발생 및 재발에 대한 중요한 위험 요인이 될 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 H형 고혈압의 동반 거주는 심혈관 및 뇌혈관 질환의 부작용을 악화시킬 수 있다고 보고되었다4. 특히 중국에서 H형 고혈압 환자의 75%가 원발성 고혈압을 앓고 있으며, 이는 삶의 질에 심각한 영향을 미친다5. 현재 H형 고혈압의 치료는 주로 서양 의학을 포함하고 있습니다. 그러나 특정 부작용과 순응도 저하를 유발할 수 있으며 더 이상 H형 고혈압의 종합적인 관리에 대한 요구를 충족시킬 수 없습니다.

중국 전통 의학(TCM)은 중국에서 2,000년 이상의 역사를 가진 독특한 자원입니다. 서양 의학에서 고혈압 조절에 대한 충족되지 않은 요구로 인해 임상의들은 H형 고혈압의 예방 및 치료에서 한의학의 잠재적 역할을 고려하기 시작했다6. Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD)은 Yue Deng 교수가 광범위한 임상 전문 지식을 바탕으로 공식화한 중국 전통 의학 공식입니다7. 20년 이상의 임상 적용 과정에서 HTJDTLD는 심혈관 및 뇌혈관 질환 치료에서 놀라운 효과를 입증했습니다1. 그러나 HTJDTLD가 H형 고혈압에 치료 효과가 있는지는 보고되지 않았습니다. 따라서 H형 고혈압 환자에서 HTJDTLD의 항고혈압 효과와 특정 기전을 탐색하고 H형 고혈압 치료를 위한 잠재적 치료 약물을 식별하는 것을 목표로 했습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 Changchun University of Chinese Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 재료는 재료 목차에 나열되어 있습니다.

1. 동물과 치료

  1. 총 50마리의 성체 자발적 고혈압 쥐(SHR)(수컷, 50일령)를 대조군(CON), 메티오닌(MET), MET + HTJDTLD + Enalapril maleate(EM), MET + EM 및 MET + HTJDTLD 그룹을 포함한 5개 그룹으로 무작위로 나눕니다.
    참고: 실험용 쥐들은 그들의 편안함과 웰빙을 보장하기 위해 설계된 통제된 환경에 수용되었습니다. 이 시설은 상대 습도가 40-60%인 22°C로 일정하게 설정된 온도 조절실을 갖추고 있습니다. 하우징 케이지는 투명한 폴리카보네이트로 만들어져 각 쥐가 자유롭게 움직일 수 있는 충분한 공간을 제공했습니다. 조명 일정은 12시간의 밝음/어두운 주기를 따라 자연광 조건을 시뮬레이션했습니다. 쥐들에게는 충분한 먹이와 물이 제공되었다.
  2. 쥐에게 28일 동안 다음과 같은 식단을 제공하십시오.
    1. MET 그룹의 쥐에게 28일 동안 3% 메티오닌 식단을 제공하여 H형 고혈압을 유발합니다.
    2. MET + HTJDTLD + EM 그룹의 랫드를 HTJDTLD(1.633g/mL) 및 EM(0.2mg/mL)과 함께 1mL/kg의 용량으로 3% 메티오닌 식단에 추가하여 투여합니다.
    3. 3% 메티오닌 식단 외에 MET + EM 및 MET + HTJDTLD 그룹의 쥐에게 각각 HTJDTLD 또는 EM을 투여합니다.
      참고: HTJDTLD는 Fructus Trichosanthis (20g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15g), Lonicerae japonicae flos (30g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15g), Radix Angelicae sinensis (15g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10g), Hirudo (5g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15g) 및 Radix Scrophulariae (15g)로 구성되며, 이전에 보고된 바와 같이 달인되었습니다7. 정제수(0.2mg/mL)에 용해된 EM이 양성 대조군으로 작용했습니다.

2. 혈압 측정

알림: 혈압 측정은 비침습적 혈압계(Table of Materials)를 사용하여 수행됩니다.

  1. 28일 동안 치료한 후 각 그룹의 쥐를 12시간 동안 단식시키고 혈압을 측정합니다.
  2. 쥐의 크기에 맞는 구속 장치를 선택하십시오. 본 연구에서 사용된 구속장치는 원통형 구속망, 캔버스 커버, 열관, 안정화 폼 패드로 구성된다. 쥐를 구속 메쉬에 넣고 구속 메쉬를 열 튜브에 넣은 다음 열 튜브를 캔버스 덮개에 넣습니다.
  3. 신호 케이블을 덮개 아래의 적절한 위치에 놓습니다. 덮개에 제공된 틈에 쥐의 꼬리를 놓고 안정화 폼 패드에 고정합니다. 측정에는 비어 있고 조용하며 따뜻한 환경이 선호됩니다. 쥐가 측정 환경에 적응할 수 있도록 20-30분 전에 측정 장소로 이동시킵니다.
    알림: 쥐를 안정시키기 위해 2.2-2.3단계를 여러 번 수행할 수 있습니다. 몇 번의 훈련 세션 후에 쥐는 그것에 익숙해지고 매우 빠르게 안정화 될 수 있으므로 후속 혈압 측정에 편리합니다.
  4. 가압 센서의 공기 호스 연결부, 신호 연결부 및 고정 튜브를 연결합니다. 가압 센서를 꼬리 끝에 놓습니다.
  5. 혈압을 측정합니다. 쥐 꼬리가 센서에 삽입된 후 맥파가 나타납니다. 시작/중지 를 눌러 측정을 시작/중지합니다.
    알림: 장치는 쥐의 꼬리가 센서에 삽입되었는지 여부를 자동으로 결정합니다. 쥐의 꼬리가 삽입되지 않으면 가압 센서가 압력을 시작하지 않고 측정을 수행하지 않습니다.
  6. 혈압 검사가 완료되면 결과 메뉴가 자동으로 팝업됩니다. 결과 메뉴에서 측정의 평균값, 표준 편차(SD), 표준 오차(SE) 및 변동 계수(CV)를 확인합니다.
    참고: 각 쥐의 혈압을 2분 이상의 간격으로 3회 측정하고 평균값을 계산했습니다.
  7. 혈압을 측정한 후 초과 2% 펜토바르비탈 나트륨(100mg/kg)을 복강 내 주사하여 쥐를 안락사시킵니다. 그런 다음 수술용 가위와 톱니 겸자를 사용하여 회음부에서 목까지 쥐를 층별로 절개합니다. 흉부와 복부 내용물을 뒤집어 두 신장 사이의 복부 대동맥 분기점으로 이동하여 대동맥을 대동맥궁의 한 부분까지 모읍니다.

3. Hematoxylin-eosin (HE) 염색

  1. 대동맥 혈관 조직을 최소 24시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
  2. 혈관 표본을 채취하여 그래디언트 알코올로 탈수하고 크실렌으로 투명하게 만든 다음 파라핀에 삽입합니다.
  3. 삽입 후 3-5mm 두께의 연속 슬라이스를 만듭니다. 슬라이스를 60-70 °C에서 건조시킨 다음 실온(RT)에서 보관합니다.
  4. 절편을 크실렌 I에 30분, 크실렌 II를 30분, 100% 알코올 I을 10분, 100% 알코올 II를 10분, 95% 알코올 I을 5분, 95% 알코올 II를 5분, 80% 알코올에 5분 동안 담근 다음 증류수로 헹굽니다.
  5. Harris hematoxylin의 섹션을 5분 동안 염색하고 수돗물로 5분 동안 헹굽니다. 1% 염산 알코올로 10초 동안 분화하고 수돗물로 15분 동안 철저히 헹굽니다. 암모니아수로 5초 동안 세척하고 수돗물로 15분 동안 철저히 헹굽니다.
  6. 현미경 관찰을 수행하고 10분 동안 에오신을 사용하여 염색하고 15분 동안 수돗물로 철저히 헹굽니다.
  7. 80% 에틸 알코올 80초 동안 10초, 95% 알코올 I을 5분 동안, 95% 알코올 II를 5분 동안, 100% 알코올 I 10분, 100% 알코올 II 10분, 크실렌 I을 10분 동안 담그어 섹션을 탈수합니다.
  8. 중성 껌을 사용하여 섹션을 밀봉하십시오.
  9. 광학 현미경(100x objective, 1000x 배율)으로 대동맥 조직의 조직학적 변화를 관찰합니다.

4. Masson의 삼색 염색

  1. HE 염색과 유사한 일상적인 탈랍을 수행합니다.
  2. 헤마톡실린 염색: 슬라이드를 헤마톡실린 용액에 10분 동안 담근 다음 즉시 수돗물로 헹굽니다.
  3. 슬라이드를 1% 염산 용액에 몇 초 동안 담근 다음 즉시 수돗물로 헹굽니다.
  4. 슬라이드를 리히텐슈타인 산성 마젠타 염색에 5분 동안 담근 다음 물로 헹굽니다.
  5. 슬라이드를 1% 포스모몰리브딕산에 5분 동안 담그십시오.
  6. 슬라이드를 2% 아닐린 블루 염색에 5분 동안 담그고 1% 빙초산 침지 세척 용액에 1분 동안 담그십시오. 그런 다음 슬라이드를 95% 알코올로 3회 빠르게 드롭 세척합니다.
  7. HE 염색과 유사한 일상적인 탈수, 투명성 및 중성 잇몸 밀봉을 수행합니다.

5. ELISA에 의한 Hcy 측정

  1. 2% 펜토바르비탈 나트륨(45mg/kg)의 복강 내 주사로 쥐를 마취하고 발가락 꼬집으로 마취 깊이를 확인합니다. 쥐를 잡고 수염을 잘라 피를 뽑을 때 접촉을 피하십시오. 구부러진 집게로 쥐의 안구를 제거하고 준비된 멸균 미세 원심 분리기 튜브에 혈액을 수집합니다. 그런 다음 초과 2% 펜토바르비탈 나트륨(100mg/kg)을 복강 내 주사하여 쥐를 안락사시킵니다.
  2. 혈액이 RT에서 10-20분 동안 자연적으로 응고되도록 한 다음 2-8°C에서 약 20분 동안 혈액을 원심분리(626-1409 x g)합니다.
  3. 상층액을 조심스럽게 모아 -80 °C의 냉장고에 보관하십시오.
  4. 키트 지침에 따라 시험관의 표준물질을 희석합니다.
  5. 빈 웰(빈 대조군 웰에 샘플 및 효소 시약이 추가되지 않고 나머지 단계는 동일함), 표준 웰 및 테스트할 샘플 웰을 설정합니다. 플레이트에 50μL의 표준물질을 추가하고, 40μL의 시료 희석 용액을 시료 웰에 넣은 다음 10μL의 혈청을 추가합니다(시료의 최종 희석은 5회입니다).
    참고: 플레이트의 웰 바닥에 샘플을 추가하십시오. 우물의 벽을 만지지 말고 부드럽게 흔들어 섞으십시오.
  6. 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  7. 30배 농축된 세척액을 증류수로 30배 희석하고 사용을 준비합니다.
  8. 밀봉 필름을 조심스럽게 제거하고 액체를 버리고 흔들어 액체를 모두 제거하십시오. 각 우물에 세척액을 채우고 30초 동안 그대로 두었다가 버립니다. 이것을 5 번 반복하고 두드려 말리십시오.
  9. 빈 웰을 제외한 각 웰에 50μL의 효소 시약을 추가합니다.
  10. 밀봉 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉한 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  11. 5.8단계를 반복합니다.
  12. 각 웰에 50μL의 컬러 현상액 A를 추가한 다음 50μL의 컬러 현상액 B를 추가하고 부드럽게 흔들어 잘 섞습니다. 37°C에서 저조도에서 10분 동안 배양합니다.
  13. 각 웰에 50μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 종료합니다(파란색이 노란색으로 바뀝니다).
  14. 빈 웰로 반응을 0으로 만들고 450nm에서 각 웰의 흡광도(OD 값)를 순차적으로 측정합니다.
    알림: 측정은 정지 용액을 추가한 후 15분 이내에 수행해야 합니다.

6. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

  1. 총 RNA를 추출합니다.
    1. 신선한 대동맥 조직을 적절한 크기(30-50mg/개)로 빠르게 자르고 액체 질소로 철저히 갈아줍니다. Trizol 시약 1mL를 넣고 잘 섞은 다음 얼음에 10분 동안 배양하여 조직을 용해시킵니다.
    2. 2250 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 펠릿이 없는 새 미세 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. 클로로포름 200μL를 넣고 15초 동안 세게 흔든 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 2250 x g 에서 4 °C에서 15분 동안 원심분리기. 혼합물은 3개의 층으로 나뉩니다: 저부 페놀-클로로포름 유기상, 중간상 및 상부 수성상.
    5. 상부 수성상을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브(Trizol의 약 60% 부피)로 조심스럽게 옮깁니다. 중간 단계를 흡인하지 마십시오. 소량의 상부 액체가 남을 수 있습니다.
    6. 같은 양의 이소프로판올을 넣고 10회 정도 뒤집어서 부드럽게 섞은 후 RT에서 10분간 방치한다.
    7. 2250 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 RNA 침전물을 75% 에탄올 1mL로 두 번 세척합니다.
    8. 2250 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기, 상층액을 버리고 실온에서 5-10 분 동안 자연 건조합니다.
    9. RNA를 15-50μL의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 물에 용해시키고 RNA 농도를 확인합니다.
  2. 역전사 및 RT-qPCR 수행(표 1)
    1. qRT-PCR에 의한 소포체 스트레스(ERS) 및 세포사멸과 관련된 유전자 발현을 검출합니다. 6.1단계에서 추출한 총 RNA를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA에 역전사합니다.
    2. 20 μL의 반응 부피에서 SYBR Green PCR 마스터 믹스와 함께 Real-Time PCR 검출 시스템을 사용하여 유전자 발현을 측정합니다.
    3. 2−ΔΔCT방법으로 데이터를 정량적으로 분석하고 β-actin의 발현에 상대적인 n-fold 차이로 표현합니다. 프라이머는 표 2에 나타내었다.

7. 웨스턴 블로팅(WB)

  1. 총 조직 단백질을 추출합니다.
    1. 1-2mL 균질화기의 구형 부분에 소량의 조직 블록을 넣고 깨끗한 가위로 조직 블록을 최대한 자릅니다.
    2. RIPA 용해 완충액 400μL(w:v=1:10)를 추가하고 균질화합니다. 그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 몇 분 후 다시 갈아서 얼음 위에 놓습니다. 연삭 과정을 여러 번 반복합니다.
    3. 30분 용해 후 피펫을 사용하여 용해물을 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 사전 냉각된 4°C 원심분리기에 넣습니다. 2250 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  2. 단백질을 정량화합니다.
    1. 키트의 지침에 따라 단백질 표준물질을 희석합니다. 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 및 2000ng/μL와 같은 표준물질의 기울기를 구합니다.
    2. 단백질 샘플 2.5μL를 채취하고 샘플 희석제를 사용하여 25μL(10배)로 희석합니다.
    3. 96웰 플레이트를 가져와서 20μL의 표준 단백질 샘플(농도 구배에 따라)과 타겟 단백질을 웰에 추가하며, 각 타겟 단백질 샘플에 대해 각각 2개의 웰을 추가합니다.
    4. 액체 A와 액체 B를 50:1의 비율로 혼합하여 현상액(사용 준비 완료)을 준비하고 각 웰에 200μL의 현상액을 추가합니다.
    5. 샘플이 추가된 96웰 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
    6. 562nm에서 흡광도를 감지합니다.
    7. 측정할 단백질의 농도를 계산합니다.
      1. 표준 단백질 농도를 수직 좌표로, 562nm에서의 흡광도를 수평 좌표로 사용하여 표준 곡선을 그립니다.
      2. 표준 곡선에서 얻은 공식과 표적 단백질의 측정된 흡광도를 기반으로 표적 단백질의 농도를 계산합니다.
    8. 마이크로 원심분리기 튜브에서 180μL의 로딩 버퍼를 20μL의 단백질 샘플에 추가합니다. 원심분리기 튜브를 금속 배스에 넣고 100°C에서 10분 동안 변성시킵니다. 변성된 단백질 WB를 사용하거나 -20 °C에서 보관하십시오.
  3. 면역블로팅을 수행합니다.
    1. 단백질 전기영동 겔을 구성합니다.
      1. 겔 주조 유리판(1mm 또는 1.5mm)을 청소하고 불어 건조하고 겔 주조 장치에 고정합니다.
      2. 표 3에 따라 10% 분리 겔을 준비한다. 유리판 사이에 구성된 분리 젤을 추가합니다. 기포가 생성되지 않도록 젤 용액을 천천히 첨가하십시오. 그런 다음 적절한 양의 무수 에탄올을 첨가하여 분리막의 액체 표면을 평평하게 만듭니다. 겔이 응고될 때까지 20-30분 동안 상온에 두십시오.
        알림: 분자량이 높을수록, 접착제의 농도가 낮아집니다., 분리 접착제의 다른 농도를 공식화해야 할 필요성에 따라.
      3. 표 3에 따라 5% 농축 겔을 준비한다. 분리 겔의 응고 후 무수 에탄올의 상층을 붓고 농축 겔을 채우고 유리판에 맞는 겔 빗을 천천히 삽입합니다 (기포가 생기지 않도록주의하십시오). 농축된 겔이 응고될 수 있도록 20-30분 동안 RT에 두십시오.
    2. 전기영동을 수행합니다.
      1. 트리스 60.5g, 글리신 375g, 도데실 설페이트나트륨(SDS) 20g의 무게를 잰다. 2L에 물을 넣고 60°C에서 가열한 다음 10x 전기영동 용액을 형성하기 위해 저어줍니다. 솔루션이 RT에 있도록 하십시오. 사용할 때 1배로 희석하십시오.
      2. 겔 주조 장치에서 접착제가 들어있는 유리판을 제거하고 물의 흐름에서 접착제 빗을 균일 한 속도로 당겨 내리는 동시에 샘플링 구멍의 기포를 배출합니다.
      3. 전기영동 탱크에 유리판을 고정하고 구성된 1x 전기영동 용액을 추가합니다. 내부 탱크가 가득 찼고 외부 탱크가 내부 탱크의 절반인지 확인하십시오.
      4. 동일한 질량의 단백질 샘플과 5μL의 마커(단백질의 크기를 나타내는 데 사용됨)를 샘플 첨가 웰에 추가합니다.
      5. 겔을 60V에서 20분 동안 실행한 다음 로딩 버퍼가 바닥까지 도달할 때까지 100V에서 90분 동안 실행합니다.
    3. 멤브레인 전달을 수행합니다.
      1. 트리스 60g과 글리신 288g의 무게를 잰 후 2L에 물을 넣고 젓고 용액을 잘 녹여 10x 멤브레인 전달 용액을 만들고 RT에서 비축합니다. 1:2:7(10x 막관통 용액: 메탄올: 물)의 비율로 희석하여 1x 작동 용액을 만듭니다.
        알림: Transmembrane 용액은 미리 준비하고 냉장고에서 4°C로 냉각해야 합니다.
      2. PVDF를 적절한 시간(0.5-1분) 동안 메탄올에 담그면 멤브레인의 양전하를 띤 그룹이 활성화되고 음전하를 띤 단백질과 쉽게 결합할 수 있습니다.
      3. 멤브레인 전사 클립을 잡고 구성 요소를 순서대로 배치한 후 고정합니다(검은색 표면-스펀지-여과지-전기영동 겔-PVDF 멤브레인-여과지-스펀지-흰색 표면 순).
        알림: 기포를 피하도록 주의하십시오. 기포가 있을 때는 롤러를 사용하여 기포를 빼내십시오.
      4. 멤브레인 이송 탱크에 부목을 놓고 올바른 전극 배치에 주의하고 탱크에 두 개의 얼음 백을 넣고 1x 멤브레인 이송 액체를 채웁니다. 마지막으로 막횡단 탱크 전체를 얼음에 넣습니다.
      5. 멤브레인 전달 조건을 1시간 동안 100V로 설정합니다.
        참고: 막 전달 시간은 단백질의 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 단백질의 분자량이 작을수록 막 전달 시간이 짧아집니다.
    4. 차단을 수행합니다.
      1. 인산화 단백질의 경우 5% BSA(용매 TBST)를 차단 용액으로 사용합니다. 인산화되지 않은 단백질의 경우 차단을 위해 5% 탈지유(용매 TBST)를 사용하십시오.
      2. 차단 용액을 적절한 크기의 접시에 붓습니다. PVDF 멤브레인을 접시에 넣고 PVDF 멤브레인이 차단 용액에 잠겼는지 확인합니다. 접시를 닫고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      3. 멤브레인을 제거합니다. 마커 디스플레이와 각 타겟 단백질의 크기에 따라 멤브레인을 적절한 크기로 자르고 일련 번호로 라벨을 붙입니다.
    5. 항체를 배양합니다.
      1. 차단 용액을 제거하고 여과지로 잔류 액체를 흡수하십시오. 해당 절단 PVDF를 해당 항체 희석액(CPR78[1:1000], TRAF2[1:1000], p-JNK[1:1000], caspase[1:1000] 및 GAPDH[1:1000] 포함)에 넣고 4°C의 회전 셰이커에 밤새 놓습니다.
      2. 1x TBST를 추가하고 RT에서 세 번(각 10분) 헹굽니다.
      3. 제조업체의 지침에 따라 2차 항체 희석액에 PVDF 멤브레인을 배양하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
      4. RT에서 1x TBST를 세 번(각 10분) 추가하여 멤브레인을 헹굽니다.
    6. PVDF 멤브레인을 개발합니다.
      1. 발광 용액 키트에 액체 A와 액체 B를 같은 부피로 혼합하고 잘 흔든 후 사용을 준비합니다.
      2. PVDF 멤브레인을 접착 필름에 올려 펴 바르고 준비된 발광제를 멤브레인에 빠르고 균일하게 첨가합니다. 빛을 피하고 상온에서 3분 동안 배양합니다.
      3. ECL(Enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블로팅 검출 시약을 사용하여 단백질 밴드를 검출합니다.

8. 데이터 분석

  1. 모든 데이터를 평균으로 표현 ± S.D. SPSS 20.0 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석으로 통계 분석을 수행합니다. p 가 0.05< 때 통계적으로 유의한 차이를 고려하십시오.

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결과

표 4 및 표 5에서 보는 바와 같이, 수축기 혈압(SBP)과 이완기 혈압(DBP)은 1주에서 4주 사이에 CON 그룹보다 MET 그룹에서 유의하게 높았다. HTJDTLD 처리 후, 쥐의 SBP와 DBP는 MET 그룹보다 유의하게 낮았다. 특히, HTJDTLD와 EM을 병용하면 HTJDTLD 단독 치료보다 강력한 항고혈압 효과가 나타났다.

HE 염색 및 Masson의 삼색 염색에 따르면, 대동맥 혈관 벽의 자궁 내막은 불완전하고 매끄럽지 않으며 매체가 상당히 두꺼워졌습니다. 평활근 세포의 증식과 비대가 있었고, 배열층의 수가 증가했으며, CON 그룹에 비해 MET 그룹의 섬유가 무질서했습니다. 그러나, 혈관 자궁내막이 더 완전하고 원활하게 회복되었고, 매체 비후화가 현저히 감소했으며, MET + HTJDTLD + EM, MET + EM 및 MET + HTJDTLD 그룹에서 내내 손상이 유의하게 완화되었습니다(

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토론

고혈압은 성인 인구의 1/3에 영향을 미치는 가장 흔한 심혈관 질환 중 하나이며 뇌졸중, 관상 동맥 심장 질환, 심부 및 신부전의 위험을 증가시킵니다8. H형 고혈압은 원발성 고혈압과 호모시스테인 수치 증가가 동시에 발생하는 특수한 유형의 고혈압으로, 수년 동안 많은 관심을 받아왔다9. 최근에는 항고혈압제와 병용한 경구용 EM의 사용으로 혈압 조절 및 혈중 Hcy 수치 저하 측면에서 효과가 향상되는 것으로 나타났지만, 여전히 많은 금기 사항, 부작용, 약물 내성 및 두통, 현기증, 피로, 기침, 저혈압 등의 단점이 있습니다. 한의학은 H형 고혈압 치료에 있어 개인 맞춤형 접근법을 통해 근본적인 원인을 해결하고, 부작용이 적은 보완 효과를 제공하여 고혈압을 장기적으로 효과적으로 관리할 수 있는 이점을 제공합니다. 이 연구에서 우리는 한의학 제식 HTJDTLD가 메티오닌에 의한 H형 고혈압에 명백한 항고혈압 효과가 있음을 발견했습니다. 더 중요한 ...

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공개 사항

우리는 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 길림성 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of Gillin Province)의 지원을 받았다. YDZJ202301ZYTS189).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1st Strand cDNA 합성 SuperMix for qPCRYeasen, 중국11149EScDNA 합성 키트 
안티 베타 액틴 항체Bioss, 중국bs-0061R
안티 카스파제 -3 항체Bioss, 중국bs-0081R
안티 GPR78 항체Abcam, 미국ab108513
안티 JNK 항체Abcam, 미국ab76572
안티 p-JNK 항체Bioss, 중국bsm-52462R
안티 토끼 IgG 항체Bioss, 중국bs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 항체Bioss, 중국bs-22372R
Bio-Rad CFX96 터치 시스템 Bio-RadCFX96real-time PCR 검출 시스템 
ECL 웨스턴 블롯 기판Merck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril 말레 산염 엽산 정제Yangzijiang Pharmaceutical Company, 중국20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus Trichosanthis중국 장춘 전통 의학 대학의 첫 번째 제휴 병원카탈로그 번호없음
Hirudo중국 장춘 전통 의학 대학의 첫 번째 제휴 병원 카탈로그번호
없음 지능형 비침습적 혈압계 Beijing Softron Biotechnology CompanyBP-2010A
Lonicerae Japonicae Flos중국 장춘 중의대학교 제1부속병원카탈로그 번호
없음 메티오닌시그마, 미국M9500
Radix Angelicae Sinensis중국 장춘 중의대학교 제1부속병원카탈로그 번호 없음
Radix et Rhizoma Glycyrrhizae중국 장춘 전통 의학 대학의 첫 번째 부속 병원카탈로그 번호
Radix et Rhizoma Nardostachyos중국 장춘 전통 의학 대학의 첫 번째 제휴 병원카탈로그 번호
Radix et Rhizoma Rhodiolae Crenulatae중국 Changchun University of Traditional Chinese Medicine의 첫 번째 제휴 병원카탈로그 번호
Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae중국 Changchun University of Traditional Chinese Medicine의 첫 번째 제휴 병원카탈로그 번호
Radix Scrophulariae중국 Changchun University of Traditional Chinese Medicine의 첫 번째 제휴 병원카탈로그 번호 없음
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, 중국MM-0293R2
RIPA 버퍼Shanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B
없음없음없음없음

참고문헌

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