संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे माउंट प्रतिदीप्ति में सीटू मच्छर घ्राण उपांगों में रसायन विज्ञान जीन के संकरण
Summary
लेख मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प में केमोसेंसरी रिसेप्टर जीन के स्थानिक और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन में अंतर्दृष्टि प्रकट करने के लिए स्वस्थानी संकरण संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) में संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति करने के लिए आवश्यक तरीकों और अभिकर्मकों का वर्णन करता है।
Abstract
मच्छर घातक बीमारियों के प्रभावी वैक्टर हैं और उनके घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी रिसेप्टर्स का उपयोग करके अपने रासायनिक वातावरण को नेविगेट कर सकते हैं। यह समझना कि परिधीय घ्राण उपांगों में केमोसेंसरी रिसेप्टर्स स्थानिक रूप से कैसे व्यवस्थित होते हैं, मच्छर घ्राण प्रणाली में गंध को कैसे एन्कोड किया जाता है, इस बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं और मच्छर जनित रोगों के प्रसार से निपटने के नए तरीकों को सूचित कर सकते हैं। स्वस्थानी संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) में तीसरी पीढ़ी के संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे माउंट प्रतिदीप्ति का उद्भव स्थानिक मानचित्रण और कई केमोसेंसरी जीन की एक साथ अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए अनुमति देता है। यहां, हम एनोफिलीज मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प पर एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश प्रदर्शन करने के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हमने आयनोट्रोपिक घ्राण रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच करके इस तकनीक की संवेदनशीलता की जांच की। हमने पूछा कि क्या वर्णित एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश तकनीक आरएनए जांच को तीन वर्णक्रमीय रूप से अलग-अलग फ्लोरोफोर्स में टेदर करके मल्टीप्लेक्स अध्ययन के लिए उपयुक्त थी। परिणामों ने सबूत प्रदान किए कि एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प घ्राण उपांगों में एक साथ कई केमोसेंसरी जीन का पता लगाने के लिए मजबूत रूप से संवेदनशील है। आगे की जांच डबल और ट्रिपल आरएनए लक्ष्यों की सह-अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश की उपयुक्तता को प्रमाणित करती है। यह तकनीक, जब संशोधनों के साथ लागू की जाती है, तो अन्य कीट प्रजातियों के घ्राण ऊतकों या अन्य उपांगों में रुचि के जीन को स्थानीय बनाने के लिए अनुकूलनीय हो सकती है।
Introduction
एनोफिलिस गैम्बिया जैसे मच्छर वैक्टर एक जटिल रासायनिक दुनिया में पनपने के लिए अपने परिधीय घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी जीन के एक समृद्ध प्रदर्शनों की सूची पर भरोसा करते हैं और मानव मेजबानों से निकलने वाले व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक गंधों की पहचान करते हैं, अमृत स्रोतों का पता लगाते हैं, और ओविपोजिशन साइटों का पता लगाते हैं1. मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पल्प कीमोसेंसरी जीन से समृद्ध होते हैं जो इन घ्राण उपांगों में गंध का पता लगाने के लिए ड्राइव करते हैं। लिगैंड-गेटेड आयन चैनलों के तीन मुख्य वर्ग मच्छरों के घ्राण उपांगों में गंध का पता लगाते हैं: गंध रिसेप्टर्स (ओआरएस), जो एक ओब्लिगेट ओडोरेंट रिसेप्टर सह-रिसेप्टर (ओर्को) के साथ कार्य करते हैं; आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स (आईआर), जो एक या अधिक आईआर कोरसेप्टर्स (आईआर 8 ए, आईआर 25 ए और आईआर 76 बी) के साथ बातचीत करते हैं; केमोसेंसरी गस्टेटरी रिसेप्टर्स (जीआर), जो कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)1,2का पता लगाने के लिए तीन प्रोटीनों के परिसर के रूप में कार्य करते हैं।
स्वस्थानी संकरण में आरएनए प्रतिदीप्ति अंतर्जात एमआरएनए3 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। सामान्य तौर पर, यह विधि एक लक्ष्य एमआरएनए के अनुक्रम पूरक के साथ एक फ्लोरोफोर-टैग किए गए एकल फंसे हुए न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करती है। लक्ष्य आरएनए के लिए फ्लोरोसेंट आरएनए जांच के बंधन ब्याज की एक प्रतिलेख व्यक्त कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है. हाल की प्रगति अब पूरे माउंट मच्छरऊतकों 4,5 में टेप का पता लगाने में सक्षम है. संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (एचसीआर) तकनीक की पहली पीढ़ी ने आरएनए-आधारित एचसीआर एम्पलीफायर का उपयोग किया; यह एक दूसरी पीढ़ी की विधि है कि बजाय एचसीआर एम्पलीफायर 6,7 के लिए इंजीनियर डीएनए का इस्तेमाल किया में सुधार किया गया था. इस उन्नयन के परिणामस्वरूप सिग्नल में 10x वृद्धि, उत्पादन लागत में नाटकीय कमी औरअभिकर्मकों के स्थायित्व में महत्वपूर्ण सुधार हुआ।
प्रोटोकॉल में, हम किसी भी जीन 8,9 के स्थानिक स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई स्वस्थानी संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) विधि में तीसरी पीढ़ी के एचसीआर पूरे-माउंट आरएनए प्रतिदीप्ति के उपयोग का वर्णन करते हैं। यह दो-चरण विधि पहले ब्याज के एमआरएनए के लिए विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करती है, लेकिन जिसमें एक सर्जक मान्यता अनुक्रम भी होता है; दूसरा चरण फ्लोरोफोरे-टैग किए गए हेयरपिन का उपयोग करता है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल (चित्रा 1) को बढ़ाने के लिए सर्जक अनुक्रम से बंधता है। यह विधि दो या दो से अधिक आरएनए जांच के मल्टीप्लेक्सिंग और आरएनए का पता लगाने औरमात्रा का ठहराव 8 की सुविधा के लिए जांच संकेतों को बढ़ाने की भी अनुमति देती है। घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी जीन के प्रतिलेख बहुतायत और आरएनए स्थानीयकरण पैटर्न की कल्पना करना कीमोसेंसरी जीन कार्यों और गंध कोडिंग में अंतर्दृष्टि की पहली पंक्ति प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (एचसीआर) की तीसरी पीढ़ी कई आरएनए लक्ष्य8 कल्पना करने के लिए अपनी संवेदनशीलता और मजबूती के लिए उल्लेखनीय है. एचसीआर डब्लूएम-फिश का ड्रोसोफिला, चिकन, चूहों और जेब्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मार्गो हेरे और लेस्ली वोशाल लैब को एडीस aegypti घ्राण उपांगों के लिए अपने इन-सीटू संकरण प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से C.J.P. (NIAID R01Al137078), JIR को HHMI हन्ना ग्रे फैलोशिप, JIR को जॉन्स हॉपकिन्स पोस्टडॉक्टोरल एक्सेलेरेटर अवार्ड और JIR को जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट और ब्लूमबर्ग परोपकार को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
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