Her præsenterer vi en protokol for den aktive stedundgåelsestest, et hippocampusafhængigt rumligt læringsparadigme designet til gnavere. Ændring af nøgleparametre gør det muligt at teste dyr igen før og efter behandlingerne eller over tid.
Hippocampus-afhængig rumlig læring hos gnavere er blevet testet ved hjælp af en række forskellige metoder. Disse omfatter Morris vandlabyrint (MWM), Y-labyrint og nye objektplaceringsopgaver (NOL). For nylig er APA-opgaven (active place avoid) blevet udviklet som et alternativ til disse mere traditionelle tilgange. I APA-opgaven skal mus bruge rumlige signaler placeret omkring en roterende arena for at undgå en stationær stødzone. På grund af de mange parametre, der kan justeres, har APA-opgaven vist sig at være en meget alsidig tilgang. Det egner sig til at blive brugt i længderetningen og gentagne gange til den samme kohorte af mus. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre APA-opgaven med succes. Vi fremhæver også alternative APA-tilgange, der kan bruges til at undersøge forskellige komponenter i rumlig læring. Vi beskriver dataindsamlings- og analyseprocesserne. Kritiske trin under APA-opgaven diskuteres for at øge sandsynligheden for en vellykket gennemførelse af testen. APA-opgaven har flere fordele i forhold til mere traditionelle rumlige navigationstest. Det er hensigtsmæssigt at anvende det sammen med ældre mus eller mus med sygdomsfænotyper såsom Alzheimers sygdom. Opgavens kompleksitet kan let ændres, hvilket gør det muligt at teste en lang række musestammer. Desuden er APA-opgaven velegnet til test af dyr, der har gennemgået kirurgi eller eksperimentelle indgreb, der kan have påvirket motorisk eller neural funktion, såsom slagtilfælde eller traumatisk hjerneskade.
Aktiv stedundgåelse (APA) er et effektivt værktøj til at teste hippocampusafhængig rumlig læring hos gnavere 1,2,3,4. Under APA-opgaven placeres dyret på en roterende arena og skal bruge visuelle signaler til at orientere sig og undgå en aversiv chokzone5. Arenaens rotation sikrer, at musen ikke er i stand til at bruge en idiotetisk tilgang til navigation, og der kan heller ikke bruges duftmærker, da disse signaler roterer på platformen, mens stødzonen forbliver stationær5. Ændring af arenaens hastighed og retning samt placeringen af stødzonen og visuelle signaler giver mulighed for gentest af mus flere gange 6,7,8. APA tilbyder flere forskellige fordele sammenlignet med Morris vandlabyrint (MWM), en af de mest anvendte rumlige læringstests. Det er vigtigt, at mus har en modvilje mod svømning og finder MWM-opgaven ekstremt stressende9. Desuden er ældre mus blevet rapporteret at flyde under MWM-opgave10, hvilket gør det uegnet som en rumlig læringsopgave i mange tilfælde. Yderligere, da MWM-opgaven kræver en skjult, nedsænket platform, som musene kan lokalisere under test. Dette kræver, at vandet er uigennemsigtigt, hvilket typisk opnås ved tilsætning af hvid maling. Sporing og analyse af dyr under adfærdsopgaver kræver tilstrækkelig kontrast mellem emne og omgivelser, hvilket udelukker visse musestammer som Swiss eller BALB / c fra at blive testet i MWM. I APA-opgaven omgås dette problem ved tilsætning af sort plast under nettet.
Flere APA-paradigmer er designet til at teste rumlig læring og demonstrere dens anvendelighed som et effektivt adfærdsværktøj. For eksempel opnås erhvervelse, fastholdelse og konsolidering af rumlig læring typisk ved daglig test af dyr, der kan variere fra 3-5 dage 6,7,11,12. Hukommelse og læring kvantificeres ved at sammenligne antallet af stød, der modtages hver erhvervelsesdag. Tid til første indgang og den maksimale tid, der undgår stødzonen, er også vigtige parametre, der kan bruges til at bestemme ændringer i indlæringsevne under opgaven. Alternativt kan rumlig arbejdshukommelse testes ved at udføre en enkelt 30 minutters APA-session 2,13, hvor rumlig læring måles som ændringer inden for sessionen ved at sammenligne ydeevne, såsom stødtal, i 5 minutters skraldespande.
I denne artikel beskriver vi APA-opgaven og fremhæver de nøglefunktioner, der skal overvejes, når du udfører denne rumlige læringstest.
Afslutningsvis er den aktive stedundgåelsestest en effektiv rumlig læringsopgave, der kan bruges på en række musestammer og eksperimentelle forhold. APA-opgaven overvinder begrænsninger forbundet med andre rumlige læringsparadigmer14, såsom MWM, hvilket er stressende for musene målt ved kortisolniveauer9. MWM er også uegnet til ældre mus, hvor de er rapporteret at flyde under opgave10. Selvom andre rumlige læringstests, såsom Barnes-labyrinten og den nye objektplaceringstest, er mindre stressende, er de begrænset af, hvor ofte gentagne test kan udføres på den samme kohorte af mus. Derfor er den største fordel ved APA-opgaven, at den kan bruges flere gange, da flere parametre kan justeres for at opretholde nyhed. Faktisk har vi brugt APA-opgaven op til 5 gange på den samme kohorte af mus til at undersøge effekten af hippocampus ablation og den efterfølgende effekt af øvelse8. I hvert tilfælde blev parametrene, herunder arenarotation, stødzone og rumlige signaler, ændret mellem testene. Dette var effektivt til at sikre, at musene brugte rumlige navigationssignaler til at genlære opgaven, som det fremgår af kontroldyrene, der startede med et stort antal stød og derefter faldt i løbet af efterfølgende testdage for hver testperiode8. I slutningen af et 5-dages testparadigme mener vi typisk, at ethvert dyr, der modtog mere end 10 stød på den sidste dag eller har en maksimal undgåelse på mindre end 60 s, ikke har lært paradigmet.
Ud over muligheden for nemt at ændre indstillinger for at tillade flere runder af rumlig test sikrer APA-opgaven, at mus skal bruge rumlig navigation for effektivt at undgå stødzonen. For eksempel skal dyr bruge eksterne signaler til at lokalisere og undgå at komme ind i den stationære stødzone ved at navigere væk fra den5. Da arenaen roterer, er dyr ikke i stand til at bruge en idiotetisk tilgang til navigation, og de kan heller ikke bruge exteroceptive signaler såsom lugt, fordi disse signaler roterer med arenaen, mens chokzonen og rumlige signaler forbliver stationære5.
Det er også vigtigt at sikre, at mus er passende vant til forskeren og APA-arenaen. Intensiteten af fodstød skal også optimeres, da både for lav og for høj stødintensitet kan kompromittere mus’ evne til at lære og udføre opgaven5. Stødintensiteten er typisk indstillet til 0,5 mA og bør ikke overstige 0,7 mA. For dyr, der har øget angstlignende adfærd, overveje at reducere både lysintensitet og fodstødintensitet. Øget angst under APA-opgaven kan vise sig som enten overdreven spring, ukontrolleret løb inden for arenaen eller langvarig frysning. Protokollen beskrevet her brugte en stødintensitet på 0,5 mA, den samme intensitet, som tidligere er blevet brugt med BALB / c, som vides at have højere angstlignende adfærd15.
Her beskriver vi dyresporingssoftwaren leveret af det firma, der leverede den aktive stedundgåelsesrig, der blev brugt. Alternativ video tracking software er også velegnet til at analysere adfærdsmæssige præstationer. Disse programmer kan også nøjagtigt måle og analysere musens ydeevne under APA-opgaver. Disse programmer tillader oprettelse af flere zoner og steder inden for APA-arenaen for at vurdere adfærd. Arenaindstillingen for en APA består af en trekantet stødzone, hvor antallet af indgange, tid til første indtrængen og tid brugt i stødzonen måles. Yderligere zoner kan også tilføjes inden for arenaen. For eksempel kan vi tilføje en central zone eller en zone modsat stødzonen for at måle den brugte tid og tilbagelagt afstand i disse zoner som en dyrestrategi for at undgå den aversive zone. Disse programmer sporer musens massecenter, som derefter gemmes og vises over referencerammen til visuel inspektion (figur 6A, B). Endelig er det også muligt at oprette et tæthedsvarmekort til individuel og gruppeydelse (figur 6C).
Når du udfører APA-opgaven, er der potentielle problemer, der skal løses. Nogle gange skal mus udelukkes fra analysen på grund af manglende respons på chokzonen. Som altid bør udelukkelse kun overvejes, når de opfylder foruddefinerede afvigende betingelser, for eksempel falder uden for 2 standardafvigelser fra gennemsnittet. Komplekse adfærdsmæssige opgaver som APA kræver typisk høje N-værdier af dyr. Vi foreslår, at du udfører en effektanalyse for at beregne den passende prøvestørrelse, før du udfører APA. Dette afhænger af den anvendte stamme og behandlingsgrupper. Erfaringen viser, at en n-værdi på 10 eller mere for hver gruppe giver tilstrækkelig effekt, når der udføres APA-eksperimenter. Hovedproblemet med denne opgave er at sikre sporing af musen af høj kvalitet under opgaven. Tilvænningsfasen af opgaven skal bruges til at bekræfte, at dette sker. Mus, der ikke reagerer på et stød, skyldes ofte scat mellem gitterstængerne. Det er derfor vigtigt at rengøre riggen efter hvert dyr og fjerne eventuel scat eller urin. Dette vil også reducere stresset for de dyr, der følger. APA-opgaven involverer typisk et 5-dages paradigme, hvilket kan give nogle begrænsninger for undersøgelser, der involverer interventioner, der er effektive mindre end 5 dage; Imidlertid kan korttidshukommelse eller rumlig læringserhvervelse stadig vurderes for sådanne undersøgelser ved hjælp af 30 min, enkeltsession-tilgangen.
Sammenfattende giver denne artikel en detaljeret beskrivelse af, hvordan man opsætter og bruger paradigmet for aktiv stedundgåelse til at teste musenes rumlige læring. Evnen til at ændre forholdene, så flere musestammer af varierende farve kan testes, er en klar fordel i forhold til andre, mere traditionelle rumlige tests såsom MWM. Endvidere giver modifikationen af flere parametre mulighed for gentagen testning, så ændringerne i rumlig læring kan sammenlignes nøjagtigt under forskellige eksperimentelle paradigmer eller under fysiologisk aldring. På kort tid har APA-testen vist sig at være et præcist og effektivt alternativ til hippocampusafhængig rumlig læring. I fremtiden kan APA-opgaven bruges som en pålidelig metode til vurdering af terapeutiske eller træningsinterventioner på kognitiv og rumlig adfærd hos både vildtype og transgene mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behaviour Facility for udviklingen og vedligeholdelsen af det apparat, der er beskrevet i dette manuskript.
Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |