이 프로토콜은 알레르기 비염의 쥐 모델을 평가하기 위한 다색 면역형광 기법을 설명합니다.
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방법 논문
Multicolor Immunoassay를 통한 알레르기 비염 쥐의 코 점막 조직 절편에서 면역형광 라벨링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환으로, 전 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미칩니다. 면역형광(IF) 염색은 오랫동안 질병 특이적 단백질 발현을 검출하기 위한 표준 기법이었지만, 기존의 IF 기법은 동일한 샘플에서 3개 이상의 단백질 발현 수준을 검출하는 데 한계가 있습니다. 그 결과, 최근 몇 년 동안 세포 또는 조직에서 여러 표적을 동시에 라벨링할 수 있는 다색 IF 기술이 개발되었습니다.
이 프로토콜은 AR의 쥐 모델을 확립하고, 비강 점막 샘플을 얻고, 다색 면역형광을 위한 기술 절차를 위한 프로세스에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였으며 행동 관찰에서 ≥5점을 받았습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과 AR 그룹에서 염증 세포 수가 증가하고 코 점막 무결성이 손상되었습니다. 다색 면역형광(mIF)은 AR 쥐의 코 점막 조직에서 RORγt 및 TICAM-1의 발현이 증가한 반면 Foxp3 발현은 감소한 것으로 나타났습니다.
서론
알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환입니다1,2. 재채기, 콧물, 코막힘, 코 가려움증 등의 증상이 특징입니다. 산업화와 도시화로 AR의 보급률이 점차 증가하여 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미치고 있습니다1. 면역형광(IF) 기법은 항체-항원 결합 반응을 활용하는 형광 염색 방법입니다. 생물학적 조직 또는 세포에서 특정 단백질의 분포 및 발현 수준을 감지하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. AR 연구에서 IF는 AR 관련 사이토카인, 염증 세포, 수용체 등을 포함한 여러 표적을 동시에 검출할 수 있어 AR 발병 기전 및 약물의 효과 탐색을 용이하게 합니다 3,4,5,6.
다색 면역형광(mIF) 염색 공정은 기존 IF와 매우 유사하며, 각 염색 라운드마다 항체 용출 단계가 추가됩니다.....
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프로토콜
실험 프로토콜 및 절차는 청두 중국 전통 의학 대학 행정 및 동물 연구 위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2022DL-010). 무게가 180-200g인 8주 된 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐를 상업적으로 획득하여( 재료 표 참조) 온도(23 ± 2°C) 및 상대 습도(55% ± 10%)를 제어하여 자연광/어두움 주기에 보관했습니다. 12마리의 쥐를 무작위로 대조군과 AR군의 두 그룹으로 나눴다. 모든 쥐는 이러한 조건에 적응하고 실험 전 일주일 동안 음식과 물을 무료로 이용할 수 있었습니다.
1. AR의 쥐 모델 구축
- 감작 용액 준비: 식염수 100mL에 30mg의 오브알부민(OVA)과 3g의 Al(OH)3을 현탁시킵니다(재료 표 참조)14,15.
- 기본 감작: 완전히 깨어 있는 쥐의 복부가 위를 향하도록 잡고 잡습니다. 알코올에 적신 면봉 75%를 사용하여 복부를 소독합니다. 1.5mL 주사기를 사용하여 1.1단계에서 제조한 감작 용액 1mL를 AR 그룹 쥐의 좌복강에 주입합....
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결과
6마리의 SD 쥐를 OVA 복강 내 주사 및 비강 챌린지를 통해 AR 모델에 성공적으로 유도했습니다. AR은 AR 그룹의 모든 쥐에서 유도되었으며, 그룹의 100%를 차지했습니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였습니다. 모든 행동 관찰은 ≥5점을 기록했다(표 2).
모델링 21일 째 H&E 염색 결과, 대조군 쥐에서 코 점막의 상피세포와 섬모가 잘 배열되어 있었고 염증성 세포 침윤의 징후는 없었습니다. 반대로, AR 그룹에서는 비중격의 점막이 손상되고 분리되어 호중구 침윤이 두드러졌습니다(그림 3).
AR 쥐의 코 점막 조직을 대조군과 비교했을 때 RORγt(Th17 세포 특이적 전사 인자) 및 TICAM-1(톨 유사 수용체 링커 분자-1)의 발현은 증가한 반면 Foxp3(.......
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토론
알레르기 비염(AR)은 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는 비감염성 비점막 염증성 질환입니다. 이는 업무 효율성에 영향을 미치고, 삶의 질을 떨어뜨리고, 수면, 인지 기능을 손상시키고, 과민성과 피로를 유발하는 세계적인 건강 문제가 되었습니다. AR은 전 세계 인구의 10%-20%에 영향을 미치며¹ 상당한 경제적 비용을 수반하여 EU 국가에서 연간 최대 30-500억 유로의 손실을 초래합니다18. 또한, 여러 연구에서 AR과 천식 18,19,20 사이에 강한 연관성이 있음이 입증되었으며, AR이 있는 사람은 AR이 없는 사람보다 천식이 발생할 가능성이 7배 더 높습니다 21. 현재 연구에 따르면 Th2 세포에 편향된 제1형 보조 T 세포(Th1)와 제2형 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 쓰촨성 과학기술부(2021YJ0175)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% 에탄올 | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| 무수 에탄올 | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| 안티 형광 담금질 실러 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 자동 염색기 | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| 캐리어 슬라이드 | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| 시트레이트-인산 완충액 | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| 구연산 항원 복구 용액 (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | ||
| 커버슬립 | 난퉁 Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-티라미드 | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| 탈색 쉐이커 | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA 석회질 제거 솔루션 | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | ||
| 전기 가열 폭발 건조기 | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
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| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| 형광 현미경 | Sunny 광학 기술 Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| 냉동 테이블 | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
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| 염소 세럼 | Biosharp | BL210A | |
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| 염산 | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
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| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
참고문헌
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Und....
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재인쇄 및 허가
