Monitoraggio dell'apprendimento motorio fine e associativo nei topi utilizzando la scala Erasmus
Summary
Questo articolo presenta un protocollo che consente una valutazione non invasiva e automatizzata delle prestazioni motorie, nonché l’apprendimento motorio adattivo e associativo su sfide, utilizzando un dispositivo chiamato Erasmus Ladder. La difficoltà del compito può essere titolata per rilevare una compromissione motoria che va da gradi maggiori a lievi.
Abstract
Il comportamento è modellato dalle azioni e le azioni richiedono abilità motorie come la forza, la coordinazione e l’apprendimento. Nessuno dei comportamenti essenziali per sostenere la vita sarebbe possibile senza la capacità di passare da una posizione all’altra. Sfortunatamente, le capacità motorie possono essere compromesse in una vasta gamma di malattie. Pertanto, lo studio dei meccanismi delle funzioni motorie a livello cellulare, molecolare e circuitale, nonché la comprensione dei sintomi, delle cause e della progressione dei disturbi motori, è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti efficaci. I modelli murini sono spesso impiegati per questo scopo.
Questo articolo descrive un protocollo che consente il monitoraggio di vari aspetti delle prestazioni motorie e dell’apprendimento nei topi utilizzando uno strumento automatizzato chiamato Erasmus Ladder. Il test prevede due fasi: una fase iniziale in cui i topi vengono addestrati a navigare su una scala orizzontale costruita con pioli irregolari (“apprendimento motorio fine”) e una seconda fase in cui viene presentato un ostacolo nel percorso dell’animale in movimento. La perturbazione può essere inaspettata (“apprendimento motorio sfidato”) o preceduta da un tono uditivo (“apprendimento motorio associativo”). L’attività è facile da svolgere ed è completamente supportata da un software automatizzato.
Questo rapporto mostra come le diverse letture del test, se analizzate con metodi statistici sensibili, consentono un monitoraggio fine delle capacità motorie del topo utilizzando una piccola coorte di topi. Proponiamo che il metodo sia altamente sensibile per valutare gli adattamenti motori guidati da modifiche ambientali e i sottili deficit motori in fase iniziale in topi mutanti con funzioni motorie compromesse.
Introduction
Sono stati sviluppati diversi test per valutare i fenotipi motori nei topi. Ogni test fornisce informazioni su un aspetto specifico del comportamento motorio1. Ad esempio, il test in campo aperto informa sulla locomozione generale e sullo stato d’ansia; i test di rotarod e walking beam sulla coordinazione e sull’equilibrio; L’analisi dell’impronta riguarda l’andatura; il tapis roulant o la ruota da corsa durante l’esercizio fisico forzato o volontario; E la ruota complessa riguarda l’apprendimento delle abilità motorie. Per analizzare i fenotipi motori del topo, i ricercatori devono eseguire questi test in sequenza, il che comporta molto tempo e sforzi e spesso diverse coorti di animali. Se ci sono informazioni a livello cellulare o circuitale, lo sperimentatore normalmente opta per un test che monitora un aspetto correlato e segue da lì. Tuttavia, mancano paradigmi che discriminino in modo automatizzato i diversi aspetti del comportamento motorio.
Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare l’Erasmus Ladder 2,3, un sistema che consente una valutazione completa di una varietà di caratteristiche di apprendimento motorio nei topi. I principali vantaggi sono la riproducibilità e la sensibilità del metodo, insieme alla capacità di titolare la difficoltà motoria e di separare i deficit nelle prestazioni motorie dalla compromissione dell’apprendimento motorio associativo. Il componente principale è costituito da una scala orizzontale con pioli alti (H) e bassi (L) alternati dotati di sensori sensibili al tocco che rilevano la posizione del mouse sulla scala. La scala è composta da 2 x 37 pioli (L, 6 mm; H, 12 mm) distanziati di 15 mm l’uno dall’altro e posizionati in uno schema alternato sinistra-destra con spazi di 30 mm (Figura 1A). I pioli possono essere spostati singolarmente per generare vari livelli di difficoltà, ovvero creare un ostacolo (alzando i pioli alti di 18 mm). Accoppiato con un sistema di registrazione automatizzato e associando le modifiche del modello di pioli con stimoli sensoriali, la scala Erasmus verifica l’apprendimento della motricità fine e l’adattamento delle prestazioni motorie in risposta a sfide ambientali (comparsa di un gradino più alto per simulare un ostacolo, uno stimolo incondizionato [US]) o l’associazione con stimoli sensoriali (un tono, uno stimolo condizionato [CS]). Il test prevede due fasi distinte, ciascuna delle quali valuta il miglioramento delle prestazioni motorie nell’arco di 4 giorni, durante le quali i topi vengono sottoposti a una sessione di 42 prove consecutive al giorno. Nella fase iniziale, i topi vengono addestrati a navigare nella scala per valutare l’apprendimento motorio “fine” o “abile”. La seconda fase consiste in prove interlacciate in cui un ostacolo sotto forma di un piolo superiore viene presentato sul percorso dell’animale in movimento. La perturbazione può essere inaspettata per valutare l’apprendimento motorio “sfidato” (studi solo negli Stati Uniti) o annunciata da un tono uditivo per valutare l’apprendimento motorio “associativo” (studi appaiati).
La scala Erasmus è stata sviluppata in tempi relativamente recenti 2,3. Non è stato ampiamente utilizzato perché l’impostazione e l’ottimizzazione del protocollo richiedeva uno sforzo mirato ed è stato specificamente progettato per valutare l’apprendimento associativo cerebellare-dipendente senza esplorare in dettaglio il suo potenziale di rivelare altri deficit motori. Ad oggi, è stato convalidato per la sua capacità di svelare sottili disturbi motori legati alla disfunzione cerebellare nei topi 3,4,5,6,7,8. Ad esempio, i topi knockout per la connessina36 (Cx36), in cui le giunzioni gap sono compromesse nei neuroni olivari, mostrano deficit di attivazione a causa della mancanza di accoppiamento elettrotonico, ma il fenotipo motorio era difficile da individuare. I test effettuati utilizzando la scala Erasmus hanno suggerito che il ruolo dei neuroni olivari inferiori in un compito di apprendimento motorio cerebellare è quello di codificare con precisione la codifica temporale degli stimoli e facilitare le risposte dipendenti dall’apprendimento a eventi inaspettati 3,4. Il topo knockout per la ribonucleoproteina 1 messaggera X fragile (Fmr1), un modello per la sindrome dell’X fragile (FXS), mostra un deterioramento cognitivo ben noto insieme a difetti più lievi nella formazione della memoria procedurale. I knockout Fmr1 non hanno mostrato differenze significative nei tempi di passo, nei passi falsi per prova o nel miglioramento delle prestazioni motorie durante le sessioni nella scala Erasmus, ma non sono riusciti ad adattare il loro modello di deambulazione all’ostacolo che appare improvvisamente rispetto ai loro compagni di cucciolata wild-type (WT), confermando specifici deficit di memoria procedurale e associativa 3,5. Inoltre, linee mutanti di topo cellulo-specifiche con difetti nella funzione cerebellare, tra cui la compromissione della produzione di cellule di Purkinje, il potenziamento e l’uscita di cellule interneuronali o granulari dello strato molecolare, hanno mostrato problemi nella coordinazione motoria con acquisizione alterata di schemi di passi efficienti e nel numero di passi compiuti per attraversare la scala6. Le lesioni cerebrali neonatali causano deficit di apprendimento cerebellare e disfunzione delle cellule di Purkinje che potrebbero essere rilevate anche con la scala Erasmus 7,8.
In questo video, presentiamo una guida completa passo passo, che descrive in dettaglio la configurazione della stanza comportamentale, il protocollo di test comportamentale e la successiva analisi dei dati. Questo rapporto è stato creato per essere accessibile e facile da usare ed è progettato specificamente per aiutare i nuovi arrivati. Questo protocollo fornisce informazioni sulle diverse fasi dell’allenamento motorio e sui modelli motori attesi che i topi adottano. Infine, l’articolo propone un flusso di lavoro sistematico per l’analisi dei dati utilizzando un potente approccio di regressione non lineare, completo di preziose raccomandazioni e suggerimenti per adattare e applicare il protocollo in altri contesti di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
La scala Erasmus presenta importanti vantaggi per la valutazione del fenotipo motorio rispetto agli approcci attuali. Il test è facile da condurre, automatizzato, riproducibile e consente ai ricercatori di valutare separatamente vari aspetti del comportamento motorio utilizzando una singola coorte di topi. Nel presente studio, la riproducibilità ha permesso la generazione di dati robusti con un piccolo numero di topi WT sfruttando le caratteristiche del dispositivo, il disegno sperimentale e i metodi di analisi. Ad ese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il tecnico audiovisivo e produttore video Rebeca De las Heras Ponce e il veterinario capo Gonzalo Moreno del Val, per la supervisione delle buone pratiche durante la sperimentazione sui topi. Il lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del GVA Excellence Program (2022/8) e dell’Agenzia spagnola per la ricerca (PID2022143237OB-I00) a Isabel Pérez-Otaño.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
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