Övervakning av fin- och associativ motorisk inlärning hos möss med hjälp av Erasmustrappan
Summary
Den här artikeln presenterar ett protokoll som möjliggör en icke-invasiv och automatiserad bedömning av finmotorisk prestanda, samt adaptiv och associativ motorisk inlärning vid utmaningar, med hjälp av en enhet som kallas Erasmus Ladder. Uppgiftens svårighetsgrad kan titreras för att upptäcka motorisk funktionsnedsättning som sträcker sig från större till subtila grader.
Abstract
Beteende formas av handlingar, och handlingar kräver motoriska färdigheter som styrka, koordination och inlärning. Inget av de beteenden som är nödvändiga för att upprätthålla livet skulle vara möjliga utan förmågan att övergå från en position till en annan. Tyvärr kan motoriken äventyras vid ett brett spektrum av sjukdomar. Därför är det avgörande att undersöka mekanismerna för motoriska funktioner på cell-, molekyl- och kretsnivå, samt att förstå symtom, orsaker och progression av motoriska störningar, för att utveckla effektiva behandlingar. Musmodeller används ofta för detta ändamål.
I den här artikeln beskrivs ett protokoll som gör det möjligt att övervaka olika aspekter av motorisk prestation och inlärning hos möss med hjälp av ett automatiserat verktyg som kallas Erasmusstegen. Analysen består av två faser: en första fas där möss tränas att navigera på en horisontell stege byggd av oregelbundna stegpinnar (“finmotorisk inlärning”), och en andra fas där ett hinder presenteras i vägen för det rörliga djuret. Störningen kan vara oväntad (“utmanad motorisk inlärning”) eller föregås av en auditiv ton (“associativ motorisk inlärning”). Uppgiften är lätt att utföra och stöds fullt ut av automatiserad programvara.
Denna rapport visar hur olika avläsningar från testet, när de analyseras med känsliga statistiska metoder, möjliggör finövervakning av musmotorik med hjälp av en liten kohort av möss. Vi föreslår att metoden kommer att vara mycket känslig för att utvärdera motoriska anpassningar som drivs av miljöförändringar samt subtila motoriska brister i tidiga stadier hos muterade möss med nedsatt motorisk funktion.
Introduction
En mängd olika tester har utvecklats för att bedöma motoriska fenotyper hos möss. Varje test ger information om en specifik aspekt av motoriskt beteende1. Till exempel informerar det öppna fälttestet om allmän rörelse och ångesttillstånd; Rotarod- och gångbalkstesterna för koordination och balans. Fotavtrycksanalys handlar om gång; löpbandet eller löphjulet vid påtvingad eller frivillig fysisk träning; Och det komplexa hjulet handlar om motorisk inlärning. För att analysera musmotoriska fenotyper måste utredarna utföra dessa tester sekventiellt, vilket innebär mycket tid och ansträngning och ofta flera djurkohorter. Om det finns information på cell- eller kretsnivå väljer utredaren normalt ett test som övervakar en relaterad aspekt och följer därifrån. Det saknas dock paradigm som särskiljer olika aspekter av motoriskt beteende på ett automatiserat sätt.
I den här artikeln beskrivs ett protokoll för att använda Erasmus Ladder 2,3, ett system som möjliggör omfattande bedömning av en mängd olika motoriska inlärningsfunktioner hos möss. De främsta fördelarna är metodens reproducerbarhet och känslighet, tillsammans med förmågan att titrera motoriska svårigheter och att separera brister i motorisk förmåga från nedsatt associativ motorisk inlärning. Huvudkomponenten består av en horisontell stege med omväxlande höga (H) och låga (L) stegpinnar utrustade med beröringskänsliga sensorer som känner av musens position på stegen. Stegen är gjord av 2 x 37 stegpinnar (L, 6 mm; H, 12 mm) med 15 mm mellanrum från varandra och placerade i ett alternerande mönster från vänster till höger med 30 mm mellanrum (figur 1A). Stegpinnar kan flyttas individuellt för att generera olika svårighetsgrader, det vill säga skapa ett hinder (höja de höga stegpinnarna med 18 mm). Tillsammans med ett automatiserat registreringssystem och associering av modifieringar av stegpinnens mönster med sensoriska stimuli, testar Erasmus-stegen finmotorisk inlärning och anpassning av motorisk prestanda som svar på miljöutmaningar (utseendet på en högre pinne för att simulera ett hinder, ett obetingat stimulus [US]) eller association med sensoriska stimuli (en ton, ett betingat stimulus [CS]). Testningen omfattar två distinkta faser, som var och en bedömer förbättring av motorisk prestanda under 4 dagar, under vilka möss genomgår en session med 42 på varandra följande försök per dag. I den inledande fasen tränas möss att navigera på stegen för att bedöma “fin” eller “skicklig” motorisk inlärning. Den andra fasen består av interfolierade försök där ett hinder i form av en högre pinne presenteras i vägen för det rörliga djuret. Störningen kan vara oväntad för att bedöma “utmanad” motorisk inlärning (endast USA-studier) eller meddelas av en auditiv ton för att bedöma “associativ” motorisk inlärning (parade försök).
Erasmustrappan har utvecklats relativt nyligen 2,3. Det har inte använts i stor utsträckning eftersom det krävdes fokuserad ansträngning för att ställa in och optimera protokollet och var speciellt utformat för att bedöma cerebellär beroende associativ inlärning utan att i detalj utforska dess potential att avslöja andra motoriska brister. Hittills har den validerats för sin förmåga att avslöja subtila motoriska funktionsnedsättningar kopplade till cerebellär dysfunktion hos möss 3,4,5,6,7,8. Till exempel visar connexin36 (Cx36) knockout-möss, där gap junctions är nedsatta i olivneuroner, avfyrningsunderskott på grund av brist på elektrotonisk koppling, men den motoriska fenotypen hade varit svår att fastställa. Tester med hjälp av Erasmus-stegen tyder på att rollen för underlägsna olivnervceller i en cerebellär motorisk inlärningsuppgift är att koda exakt tidsmässig kodning av stimuli och underlätta inlärningsberoende svar på oväntade händelser 3,4. Fragil X Messenger Ribonukleoprotein 1 (Fmr1) knockoutmus, en modell för Fragile-X-syndrom (FXS), uppvisar en välkänd kognitiv försämring tillsammans med mildare defekter i procedurminnesbildning. Fmr1-knockouts visade inga signifikanta skillnader i stegtider, felsteg per försök eller förbättrad motorisk prestation jämfört med sessioner i Erasmusstegen, men misslyckades med att anpassa sitt gångmönster till det plötsligt uppdykande hindret jämfört med deras kullsyskon av vildtyp (WT), vilket bekräftar specifika procedurella och associativa minnesbrister 3,5. Dessutom uppvisade cellspecifika musmutantlinjer med defekter i lillhjärnans funktion, inklusive försämrad Purkinje-cellproduktion, potentiering och molekyllagerinterneuron- eller granulcellutgångar, problem i motorisk koordination med förändrad inlärning av effektiva stegmönster och i antalet steg som togs för att korsa stegen6. Hjärnskada hos nyfödda orsakar inlärningssvårigheter i lillhjärnan och Purkinjecelldysfunktion som också kunde upptäckas med Erasmus Ladder 7,8.
I den här videon presenterar vi en omfattande steg-för-steg-guide som beskriver installationen av beteenderummet, beteendetestprotokollet och efterföljande dataanalys. Denna rapport är utformad för att vara tillgänglig och användarvänlig och är utformad speciellt för att hjälpa nykomlingar. Detta protokoll ger insikt i olika faser av motorisk träning och förväntade motoriska mönster som möss antar. Slutligen föreslår artikeln ett systematiskt arbetsflöde för dataanalys med hjälp av en kraftfull icke-linjär regressionsmetod, komplett med värdefulla rekommendationer och förslag för att anpassa och tillämpa protokollet i andra forskningssammanhang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erasmusstegen innebär stora fördelar för bedömning av motorfenotyper utöver de nuvarande metoderna. Testning är lätt att utföra, automatiserad, reproducerbar och gör det möjligt för forskare att bedöma olika aspekter av motoriskt beteende separat med hjälp av en enda muskohort. I den aktuella studien möjliggjorde reproducerbarheten generering av robusta data med ett litet antal WT-möss som drog nytta av enhetens egenskaper, experimentell design och analysmetoder. Till exempel, jämfört med traditionella s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar audiovisuella teknikern och videoproducenten Rebeca De las Heras Ponce samt chefsveterinären Gonzalo Moreno del Val, för övervakningen av god praxis under musförsök. Arbetet finansierades av anslag från GVA Excellence Program (2022/8) och den spanska forskningsbyrån (PID2022143237OB-I00) till Isabel Pérez-Otaño.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- . Available from: https://www.noldus.com/erasmusladder (2023)
- Cupido, A., et al. . Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
