미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
척추는 척추동물을 정의하고 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관을 형성합니다. 포유류 중추신경계의 적절한 발달과 기능은 미세아교세포(microglia)로 알려진 상주 대식세포의 활동에 크게 의존합니다. 미세아교세포는 이질성과 다기능성을 나타내어 척수와 뇌 내에서 뚜렷한 유전자 발현과 행동을 가능하게 합니다. 수많은 연구에서 대뇌 미세아교세포의 기능을 탐구하여 정화 방법을 광범위하게 설명했습니다. 그러나 생쥐의 척수에서 미세아교세포를 정제하는 것은 포괄적인 설명이 부족합니다. 대조적으로, 정제되지 않은 추출물과 달리 고도로 정제된 콜라겐분해효소의 활용은 중추 신경계 조직 내에서보고가 부족합니다. 이 연구에서는 8-10주 된 C57BL/6 마우스에서 척추와 척수를 절제했습니다. 후속 분해는 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용했고, 미세아교세포 정제는 밀도 구배를 이용했습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 염색을 거쳐 CD11b 및 CD45 염색을 통해 생존율과 순도를 평가했습니다. 그 결과 평균 생존율은 80%, 평균 순도는 95%였습니다. 결론적으로, 마우스 미세아교세포의 조작은 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용한 분해와 밀도 구배를 수반했습니다. 이 접근법은 상당한 척수 미세아교세포 개체군을 효과적으로 생산했습니다.
서론
척추 동물의 특징은 척추 기둥 또는 척추이며, 척추 뼈는 척추 디스크로 나뉘어 진 척추 뼈라고 불리는 일련의 분절 된 뼈로 대체되었습니다. 이러한 골성 물질의 연속은 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관(spinal canal)을 형성한다1. Rodentia 속의 척추는 일반적으로 7 개의 경추, 13 개의 흉추, 6 개의 요추 및 다양한 수의 꼬리 척추 2,3에 의해 형성됩니다. 척수의 길이는 척추의 길이와 비슷하며, 말단 종사는 척수를 천골에 고정하는 비신경 구조입니다. 또한, 신경 섬유는 추간공(intervertebral foramen)을 통해 빠져나간다 1.
포유류에서 중추신경계의 발달과 적절한 기능은 미세아교세포(microglia4)라고 불리는 신경계의 상주 대식세포의 활동에 결정적으로 의존한다. 미세아교세포는 처음에 뇌 상주 식세포로 기술되었지만, 최근 연구는 이러한 세포에 많은 동적 기능을 부여했습니다 5,6
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프로토콜
이 연구는 공식 멕시코 표준 NOM-062-ZOO-1999 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 대한 승인은 멕시코 아동 병원의 연구, 윤리 및 생물 안전 위원회(HIM/2023/006)와 멕시코 종합 병원 에두아르도 리체아가의 연구 및 생명 윤리 위원회(DI/21/501/04/62)로부터 획득되었습니다. 생후 6주에서 8주령의 C57BL/6 마우스 3마리를 멕시코 아동 병원에서 입수하여 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 환기 랙에서 격리된 조건에서 사육했습니다.
1. 재료 및 시약의 준비
- Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 PBS와 Hank의 균형 소금 용액(HBSS)을 37°C로 예열합니다.
- HBSS 용액에 리베라아제 100μg/mL와 DNase(HBSS-LD) 4μg/mL를 보충합니다. 용액이 7.4의 생리학적 pH를 유지하는지 확인하십시오.
참고: 척수당 1mL의 작업 용액이 필요합니다. - 밀도 구배 원심분리를 위한 등장성 90% 용액(상업적으로 이용 가능, 재료 표 참조)을 준비하고 37°C로 예열합니다.
- 5% 열 비활성화 소 ....
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결과
쥐의 척수 조직을 이용하여, 콜라겐분해효소와 써모리진이 고도로 농축된 혼합물을 사용하여 효소 소화를 수행하였다. 그 결과 소화된 조직은 40μm 필터를 통과하여 소화되지 않은 물질을 제거했습니다. 수집된 세포는 퍼콜 밀도 구배를 통해 농축되었으며, 하부는 90%, 상부는 45%였습니다. 그런 다음 계면 내의 미세아교세포가 풍부한 세포를 CD45 및 CD11b 항체로 염색하고 유세포 분석을 실시했습니다(그림 1).
후두부에서 천골까지 뻗어 있는 척추의 해부는 척추 주위 근육의 노출과 해부를 포함합니다. 척추를 풀어주기 위해 늑골 아치를 노출시키고 척추 T13에서 T1까지 측정을 수행했습니다. 두개골 및 천골과 관절을 이루는 척추가 보이기 시작했고, 이를 완전히 해방시키기 위해 양쪽을 절개했습니다(그림 2).
척수의 발치는 척추.......
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토론
뇌 항상성에서의 중요성 때문에 미세아교세포 연구를 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 방법에서, 미세아교세포는 전형적으로 배아 또는 신생아 쥐 및 마우스의 대뇌 반구에서 공급된다17. 제한된 수의 연구가 성체 마우스의 척수에서 미세아교세포의 정제를 다루었다13,14. 이러한 기술에는 DNAse와 함께 콜라겐분해효소 및/또는 파파인을 사용한 효소 분해가 포함되며, 종종 Percoll 또는 OptiPrep을 사용한 그래디언트 분리와 결합됩니다. 그러나, 그래디언트 분리 없이 파파인 기반 척수 소화를 사용하면 pia mater14,17을 제거한 후에도 성상교세포 오염이 발생할 수 있습니다.
이 연구는 성체 쥐 척수에서 미세아.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 702361(National Council of Science and Technology)에서 수여하는 장학금의 지원으로 이루어졌습니다. 저자는 국립 폴리테크닉 연구소(National Polytechnic Institute)의 국립 생물 과학 학교(National School of Biological Sciences)의 생물 화학 과학 박사 과정을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 수집 튜브 | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL 마이크로튜브 | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, 미국 | 101302 | |
| 50 mL 수집 튜브 | Corning, USA | 430829 | |
| 70% 에탄올 | |||
| 항생제-항진균제(페니실린, 스트렙토마이신, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| 항체 CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| 항체 CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, 미국 | 103130 | |
| 평형 소금 용액 (PBS) 칼슘 - 마그네슘 프리 | Corning, 미국 | 46-013-CM | |
| 블루 셀 스트레이너 40 μ m | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear 미처리 | 미국 코닝 | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, 미국 | 88870001 | |
| 의 | 미세 수술용 겸자 해부 | ||
| s 변형 독수리&급성; s 중고 포도당(DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| 전기 면도기 | |||
| FACS 튜브 | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| 플로우 사이토미터 Cytoflex | 베크먼 쿨터 | ||
| 행크 S 균형 잡힌 소금 용액 | Merck, 미국 | H2387 | |
| L-글루타민 | Corning, 미국 | ||
| 리베라제 TM | Roche, 미국 | 5401119001 | |
| Neubauer 챔버 계수 챔버 | 중국 | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, 미국 | 17089101 | 밀도 구배 원심분리 |
| 폴리-L-라이신 용액 | Merck, 미국 | P8920 | |
| 메스 No. 25 | HERGOM, 멕시코 | H23 | |
| Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브 2mL | Axygen, 미국 | 10011-680 | |
| 실체 현미경 | Velab, 멕시코 | HG927831 | |
| 스트레이트 수술용 가위(10cm) | HERGOM, 멕시코 | ||
| 스트레이트 바나스 가위 | HERGOM, 멕시코 | ||
| Triton X100 | Merck, 미국 | X100 | |
| 트리판 블루 스테인 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, 중국 | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, 미국 | 423102 | 아민 반응성 형광 염료 염색 |
참고문헌
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al.
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재인쇄 및 허가
