Real-time imaging av akrosomal kalsiumdynamikk og eksocytose i levende mus sperm
Summary
AcroSensE-musemodellen og levende celleavbildningsmetoder beskrevet her, gir en ny tilnærming til å studere kalsiumdynamikk i det subcellulære rommet til sædakrosomet og hvordan de regulerer mellomliggende trinn som fører til membranfusjon og akrosomeksocytose.
Abstract
Akrosom eksocytose (AE), hvor spermens enkelt eksocytotiske vesikkel smelter sammen med plasmamembranen, er en kompleks, kalsiumavhengig prosess som er avgjørende for befruktning. Imidlertid er vår forståelse av hvordan kalsiumsignalering regulerer AE fortsatt ufullstendig. Spesielt er samspillet mellom intraakrosomal kalsiumdynamikk og de mellomliggende trinnene som fører til bivirkninger ikke veldefinert. Her beskriver vi en metode som gir romlig og tidsmessig innsikt i akrosomal kalsiumdynamikk og deres forhold til membranfusjon og påfølgende eksocytose av akrosomvesikkelen. Metoden benytter en ny transgen mus som uttrykker en akrosom-målrettet sensor for eksocytose (AcroSensE). Sensoren kombinerer en genetisk kodet kalsiumindikator (GCaMP) smeltet sammen med mCherry. Dette fusjonsproteinet ble spesielt utviklet for å muliggjøre samtidig observasjon av akrosomal kalsiumdynamikk og membranfusjonshendelser. Sanntidsovervåking av akrosomal kalsiumdynamikk og AE i levende AcroSensE-sædceller oppnås ved hjelp av en kombinasjon av bildebehandling med høy bildefrekvens og et stimulerende leveringssystem som kan målrette mot enkeltspermier. Denne protokollen gir også flere eksempler på grunnleggende metoder for å kvantifisere og analysere rådataene. Fordi AcroSensE-modellen er genetisk kodet, kan dens vitenskapelige betydning forsterkes ved å bruke lett tilgjengelige genetiske verktøy, for eksempel kryssavl med andre genetiske modeller fra mus eller genredigering (CRISPR) baserte metoder. Med denne strategien kan rollene til ytterligere signalveier i spermkapasitasjon og befruktning løses. Oppsummert gir metoden beskrevet her et praktisk og effektivt verktøy for å studere kalsiumdynamikk i et spesifikt subcellulært rom – sædakrosomet – og hvordan disse dynamikkene regulerer mellomtrinnene som fører til membranfusjon og akrosomeksocytose.
Introduction
Sperm tilegne seg evnen til å befrukte under en prosess som kalles kapasitasjon1. Et endepunkt i denne prosessen er at sædcellene får evnen til å gjennomgå AE. Over to tiår med data støtter tilstedeværelsen av en kompleks, flertrinnsmodell av AE i pattedyrsperm (oppsummert i 2,3). Imidlertid er det utfordrende å studere AE i levende sæd, og tilgjengelige metoder for å overvåke denne prosessen med tilstrekkelig oppløsning er tungvint og krever flere forberedelsestrinn4, er begrenset til påvisning av det siste trinnet av bivirkninger (f.eks. ved bruk av PNA5), er begrenset til målinger av endringer i cytosolisk kalsium (i motsetning til akrosomal kalsiumdynamikk), eller er begrenset til målinger av enten cytosolisk kalsiumdynamikk eller AE6.
For å overvinne noen av de viktigste begrensningene i sanntids bivirkningsstudier under fysiologiske forhold og for å muliggjøre undersøkelse av samspillet mellom kalsiumdynamikk og AE, ble det generert en unik musemodell. I denne musemodellen uttrykkes et fusjonsprotein sammensatt av den genetisk kodede Ca2+-sensoren (GCaMP3) og mCherry og målrettes mot akrosomet ved hjelp av en akrosinpromotor og signalpeptid2. Den målrettede doble GCaMP3-mCherry-sensoren muliggjør samtidige sanntidsmålinger av kalsiumkonsentrasjoner og status for det akrosomale innholdet i levende sæd under fysiologiske forhold ved hjelp av mikroskopi og et enkeltcellestimulerende leveringssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomale matrisen vil membranfusjon og AE resultere i tap av den fotostabile og pH-ufølsomme mCherry-fluorescensen fra sæden, da dette proteinet diffunderer ut av akrosomvesikkelen. I denne forbindelse er modellens evne til å reflektere timingen og forekomsten av AE beslektet med fordelene med den akrosommålrettede GFP-muselinjen 7,8,9.
GCaMP3-varianten som brukes i denne transgene muselinjen har en omtrentlig KD på 400 μM og et dynamisk område for Ca2+ på 10-4-10-3 M10, som passer for denne vesikkelen. Vi viste at denne kombinasjonen av funksjoner i GCaMP3 kunne avsløre fusjonsporedannelse mellom plasmamembranen og den ytre akrosomale membranen (OAM)2. Fusjonsporedeteksjonen er et resultat av at porestørrelsen er for liten til at AcroSensE-proteinet kan spre seg ut av akrosomet (via tap av akrosominnhold) samtidig som det gir en membrankanal som muliggjør tilstrømning av Ca2+-ioner til akrosomlumen, noe som fører til en økning i fluorescensintensiteten til GCaMP3.
Det lyse, monomere, ikke-kalsiumfølsomme fluorescerende proteinet mCherry støtter visualisering av akrosomet mens GCaMP3-signalet er svakt (f.eks. Før Ca2+ -binding, figur 2), og viktigere, det muliggjør også identifisering av akrosomintakte sædceller som er egnet for avbildning.
Følgende protokoll beskriver bruken av den unike AcroSensE-musemodellen og metodene for mikroskopi som brukes eksperimentelt for å studere AE og sædkalsiumdynamikk med høy romlig og tidsmessig oppløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives en mikroskopibasert metode for å utnytte den nylig genererte AcroSensE-musemodellen for sanntids, encelleovervåking og analyse av samspillet mellom akrosomal kalsiumdynamikk og mellomtrinn som fører til AE. Sammen med lett tilgjengelige genetiske tilnærminger, for eksempel kryssavl med andre musegenetiske modeller eller genredigering, gir denne modellen og metoden et kraftig system for å studere rollen til forskjellige komponenter og veier som deltar i sædsignalveier relatert til kapasitasjon, AE og b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01-HD093827 og R03-HD090304 (AJT).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
