Summary

Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Published: October 13, 2023
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Summary

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Abstract

A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico – o acrossoma espermático – e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.

Introduction

Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação1. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em 2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação4, são limitados à detecção da etapa final do EA (por exemplo, usando PNA5), são limitados a medidas de alterações no cálcio citosólico (em contraste com a dinâmica do cálcio acrossomal), ou limitam-se a medidas da dinâmica citosólica do cálcio ou AE6.

Para superar algumas das principais limitações dos estudos de EA em tempo real sob condições fisiológicas e permitir a investigação da interação entre a dinâmica do cálcio e EA, um modelo único de camundongo foi gerado. Neste modelo de camundongo, uma proteína de fusão composta pelo sensor Ca2+ codificado geneticamente (GCaMP3) e mCherry é expressa e direcionada para o acrossoma usando um promotor de acrosina e peptídeo de sinalização2. O sensor duplo GCaMP3-mCherry direcionado permite medições simultâneas em tempo real das concentrações de cálcio e do estado do conteúdo acrossomal em espermatozoides vivos em condições fisiológicas usando microscopia e um sistema de liberação de estimulante de célula única (Figura 1). Como componente da matriz acrisomal, a fusão da membrana e o AE resultariam na perda da fluorescência mCherry fotosestável e insensível ao pH do espermatozoide, uma vez que essa proteína se difunde para fora da vesícula do acrossoma. Nesse sentido, a capacidade do modelo de refletir o momento e a ocorrência de EA é semelhante aos benefícios da linhagem de camundongos GFP direcionada para acrossoma7,8,9.

A variante GCaMP3 usada nesta linha de camundongos transgênicos tem um KD aproximado de 400 μM e uma faixa dinâmica para Ca2+ de 10-4-10-3 M10, o que é adequado para esta vesícula. Mostramos que essa combinação de características da GCaMP3 poderia revelar a formação de poros de fusão entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa (MAO)2. A detecção de poros de fusão é resultado do tamanho dos poros ser muito pequeno para permitir que a proteína AcroSensE se disperse para fora do acrossoma (através da perda de conteúdo acrossomo) enquanto fornece um “canal” de membrana que permite o influxo de íons Ca2+ no lúmen acrossomo, levando a um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP3.

A proteína fluorescente brilhante, monomérica e não sensível ao cálcio mCherry suporta a visualização do acrossoma enquanto o sinal GCaMP3 é fraco (por exemplo, antes da ligação de Ca2+ , Figura 2) e, importante, também permite a identificação de espermatozoides intactos de acrossoma adequados para exames de imagem.

O protocolo a seguir descreve a utilização do modelo único de camundongos AcroSensE e os métodos de microscopia usados experimentalmente para estudar a dinâmica do cálcio espermático e AE com alta resolução espacial e temporal.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE2 com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente. 1. Coleta e lavagem de espermatozoides Coletar esperma…

Representative Results

A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência a…

Discussion

Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T).

Materials

100x oil objective  Olympus Japan UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin  Sigma C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness MatTek Corp.  P35G-1.5-20-C 
5 mL round-bottomed tube Falcon 352054
Borosilicate glass capilarries Sutter Instrument Co. CA USA B200-156-10
CaCl2 Sigma C4901
Confocal microscope Olympus Japan Olympus FluoView 
Glucose  Sigma G7528
Graduated tip  TipOne, USA Scientific
HEPES Sigma H7006
ImageJ  National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl Sigma P9541
Lactic acid Sigma G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems  TOKAI HIT Shizuoka, Japan Model STX
MgCl2 Sigma M8266
Micropipette Puller  Sutter Instrument Co. CA USA Model P-97
NaCl Sigma S3014
NaHCO3 Sigma S6297
Plastic transfer pipette  FisherBrand  13-711-6M
Poly-D-lysine  Sigma P7280
Pyruvic acid Sigma 107360
Single cell delivery system Parker, Hauppauge, NY Picospritzer III

References

  1. Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
  2. Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
  3. Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
  4. Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
  5. Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
  6. Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
  7. Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
  8. Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
  9. Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
  10. Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
  12. Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
  13. Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).

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Cite This Article
Cohen, R., Sosnicki, D. M., White, M. A., Nelson, J. L., Mukai, C., Travis, A. J. Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm. J. Vis. Exp. (200), e65962, doi:10.3791/65962 (2023).

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