Denne protokol præsenterer et assay til modellering af forstoppelse i en alfa-synucleinbaseret Drosophila-model af Parkinsons sygdom.
Ikke-motoriske symptomer i Parkinsons sygdom (PD) er almindelige, vanskelige at behandle og forringer livskvaliteten betydeligt. Et udbredt ikke-motorisk symptom er forstoppelse, som kan gå forud for diagnosen PD med år eller endda årtier. Forstoppelse er blevet underudforsket i dyremodeller af PD og mangler specifikke terapier. Dette assay anvender en Drosophila-model af PD, hvor humant alfa-synuclein udtrykkes under en pan-neuronal driver. Fluer, der udtrykker alfa-synuclein, udvikler kendetegnende træk ved PD: tabet af dopaminerge neuroner, motorisk svækkelse og alfa-synucleinindeslutninger.
Denne protokol skitserer en metode til at studere forstoppelse i disse fluer. Fluer placeres på fluemad med et blåt farvetilsætningsstof natten over og overføres derefter til standardfoder den følgende dag. De flyttes efterfølgende til nye hætteglas med standard fluefoder hver time i 8 timer. Før hver overførsel beregnes procentdelen af blåfarvede fækale pletter sammenlignet med de samlede fækale pletter på hætteglasvæggen. Kontrolfluer, der mangler alfa-synuclein, udviser alt det blå farvestof timer før fluer, der udtrykker alfa-synuclein. Derudover kan passagen af blåfarvet mad fra tarmen overvåges med simpel fotografering. Enkelheden af dette assay gør det muligt at anvende det i fremadrettede genetiske eller kemiske skærme til at identificere modifikatorer af forstoppelse i Drosophila.
Parkinsons sygdom (PD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse karakteriseret klinisk ved tilstedeværelsen af motoriske symptomer såsom bradykinesi, stivhed og tremor, hvilket resulterer i signifikant sygelighed1. Patologisk defineres PD ved tabet af dopaminerge neuroner i substantia nigra og misfoldning af alfa-synuclein, hvilket fører til dannelsen af Lewy-kroppe og Lewy-neuritter. Patogenesen af PD er stadig dårligt forstået, sandsynligvis som følge af et komplekst samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer 2,3. I øjeblikket er sygdomsmodificerende terapier ikke tilgængelige, muligvis delvis på grund af det avancerede stadium af patologi, der er til stede på diagnosetidspunktet. Undersøgelser har vist, at mere end 60% af dopaminerge neuroner i substantia nigra allerede er gået tabt ved begyndelsen af motoriske symptomer, hvilket understreger behovet for at udforske potentielle biomarkører til tidlig sygdomspåvisning4. En sådan klinisk biomarkør er forstoppelse, som er almindelig hos PD-patienter 5,6 og kan gå forud for motorisk symptomdebut med år eller endda årtier.
På trods af PD’s kliniske definition baseret på motoriske symptomer er forstoppelse et af flere ikke-motoriske symptomer, der er mere udfordrende at behandle symptomatisk og forårsager betydelig forringelse af patienternes livskvalitet7. Ændringer i tarm-hjerneaksen, som repræsenterer tovejskommunikation mellem hjernen og det enteriske nervesystem, har været impliceret i PD-patogenese. Alfa-synucleinaggregater er fundet i vævsprøver fra mave-tarmkanalen hos PD-patienter8, og dyremodeller tyder på, at alfa-synucleinaggregater i det enteriske nervesystem spredes på en prionlignende måde til centralnervesystemet9. Derudover udviser PD-patienter abnormiteter i tarmmikrobiomet10 og kan opleve overdreven tarmbetændelse11. Forstoppelse i PD er blevet underundersøgt, med få rapporterede modeller af Parkinsons-associeret forstoppelse hos fluer 12,13eller gnavere14,15.
Dette assay anvender en Drosophila-model af PD, hvor fluer udtrykker det humane alfa-synuclein-gen under kontrol af en pan-neuronal driver, n-synaptobrevin. Disse fluer udviser alle kendetegnende træk ved PD, herunder alfa-synucleinaggregering, motorisk dysfunktion og aldersrelateret neurodegeneration, hvilket resulterer i tab af dopaminerge neuroner16,17. Tidligere undersøgelser har introduceret måling af fækal produktion i fluer for at vurdere tarmdysfunktion, kvantificering af fluefækalt stof og sammenligning af udskillelsesmængder på tværs af forskellige genetiske linjer for at afsløre funktionelle forskelle i fordøjelsessystemet 18,19,20. Her demonstrerer vi forstoppelsesanalysen ved hjælp af fluer, der udtrykker humant alfa-synuclein. Dette enkle, men værdifulde værktøj muliggør undersøgelse af et vigtigt ikke-motorisk symptom på PD.
Der er flere trin i denne protokol, der vil hjælpe med en vellykket gennemførelse af analysen. For det første er det vigtigt at sikre, at tidsintervallerne mellem hver runde for hvert hætteglas er konsistente gennem hele eksperimentet. Mærkning af hætteglassene med tal hjælper med at undgå behovet for lange genotypebeskrivelser, hvilket sparer tid. Derudover er det afgørende, at metoden til tælling af fækalt stof22 forbliver konsistent gennem hele eksperimentet. Mens blåt fækalt stof er synligt på fødevare- og hætteglasproppen, er farveløst fækalt stof ikke. Tæl derfor ikke de blå prikker på mad- eller hætteglasproppen.
Med adfærdsmæssige analyser er der altid mulighed for uoverensstemmelser i resultaterne på grund af udsving i flueadfærd eller ukendte variabler, der påvirker analysen. Vi anbefaler at bruge det samme Drosophila-medie , det samme madfarvestof og det samme mærke hætteglas til alle eksperimenter. Interessant nok blev det i flere forsøg observeret, at fluer har tendens til at afværge sjældnere tidligt på eftermiddagen, muligvis på grund af fluernes døgnrytme23. Denne adfærd er imidlertid konsistent i både kontrolfluer og fluer, der udtrykker alfa-synuclein, så det bør ikke give anledning til bekymring.
Hvis fluerne ikke udskiller blåt fækalt stof i begyndelsen af analysen, er det muligt, at det anvendte farvestof ikke er pigmenteret nok. I dette tilfælde kan man øge forholdet mellem farvestof og destilleret vand i overensstemmelse hermed. Det er også muligt, at når der kun er en lille mængde blå mad tilbage i fluens fordøjelseskanalen, kan det være svært at afgøre, om fækalt stof er lyseblåt eller farveløst. Når dette sker, vil placering af et hvidt ark papir bag hætteglasset hjælpe med at bestemme farven på fækalprikken. Selvom fækalt stof er meget lyseblåt, er det bedst at registrere det som blåt fækalt stof snarere end farveløst fækalt stof.
En begrænsning af dette assay er, at det kræver manuel tælling af fækale pletter. For at forbedre potentialet for screening med høj kapacitet kan denne protokol ændres i fremtiden for at muliggøre automatiseret kvantificering af blå fækale pletter produceret af individuelle fluer i plader med flere brønde. En anden begrænsning er, at selvom alfa-synuclein-modellen har potentialet til at blive udviklet til en prodromal model af PD, er der endnu ikke identificeret et optimalt tidspunkt, hvor forstoppelse er til stede uden neurodegeneration.
Sammenfattende tilbyder denne metode en enkel, ligetil tilgang til modellering af forstoppelse, et understuderet ikke-motorisk PD-symptom, i en Drosophila-model af PD.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Dr. Mel Feany på Brigham and Women’s Hospital og Harvard Medical School for den venlige gave af kontrol og alfa-synuclein, der udtrykker Drosophila-linjer . Vi anerkender følgende kilder til tilskud til Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinsons sygdom Early Investigator Award.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |