Detta protokoll presenterar en analys för modellering av förstoppning i en alfa-synukleinbaserad Drosophila-modell av Parkinsons sjukdom.
Icke-motoriska symtom vid Parkinsons sjukdom (PD) är vanliga, svårbehandlade och försämrar livskvaliteten avsevärt. Ett vanligt icke-motoriskt symptom är förstoppning, som kan föregå diagnosen PD med år eller till och med decennier. Förstoppning har varit underutforskat i djurmodeller av Parkinsons sjukdom och saknar specifika behandlingar. Denna analys använder en Drosophila-modell av PD där humant alfa-synuklein uttrycks under en pan-neuronal drivrutin. Flugor som uttrycker alfa-synuklein utvecklar de kännetecknande egenskaperna hos PD: förlust av dopaminerga neuroner, motorisk försämring och alfa-synukleininklusioner.
Detta protokoll beskriver en metod för att studera förstoppning hos dessa flugor. Flugor placeras på flugfoder med en blå färgtillsats över natten och överförs sedan till standardfoder dagen efter. De flyttas sedan till nya flaskor med vanligt flugfoder varje timme i 8 timmar. Före varje överföring beräknas procentandelen blåfärgade fekala fläckar jämfört med det totala antalet fekala fläckar på flaskans vägg. Kontrollflugor som saknar alfa-synuklein utsöndrar allt blått färgämne timmar före flugor som uttrycker alfa-synuklein. Dessutom kan passagen av blåfärgad mat från tarmen övervakas med enkel fotografering. Enkelheten i denna analys gör det möjligt att använda den i framåtriktade genetiska eller kemiska screeningar för att identifiera modifierare av förstoppning hos Drosophila.
Parkinsons sjukdom (PD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som kliniskt kännetecknas av förekomsten av motoriska symtom som bradykinesi, rigiditet och tremor, vilket resulterar i betydande morbiditet1. Patologiskt definieras PD av förlusten av dopaminerga neuroner i substantia nigra och felveckning av alfa-synuklein, vilket leder till bildandet av Lewykroppar och Lewyneuriter. Patogenesen för Parkinsons sjukdom är fortfarande dåligt förstådd och beror sannolikt på ett komplext samspel mellan genetiska och miljömässiga faktorer 2,3. För närvarande finns det inga sjukdomsmodifierande terapier tillgängliga, möjligen delvis på grund av det avancerade stadium av patologi som finns vid tidpunkten för diagnosen. Studier har visat att mer än 60 % av de dopaminerga nervcellerna i substantia nigra redan har förlorats vid uppkomsten av motoriska symtom, vilket understryker behovet av att utforska potentiella biomarkörer för tidig upptäckt av sjukdomen4. En sådan klinisk biomarkör är förstoppning, som är vanligt hos PD-patienter 5,6 och kan föregå motoriska symtom med år eller till och med decennier.
Trots PD:s kliniska definition baserad på motoriska symtom är förstoppning ett av flera icke-motoriska symtom som är mer utmanande att behandla symtomatiskt och orsakar betydande försämring av patienternas livskvalitet7. Förändringar i tarm-hjärna-axeln, som representerar dubbelriktad kommunikation mellan hjärnan och det enteriska nervsystemet, har varit inblandade i PD-patogenesen. Alfa-synukleinaggregat har hittats i vävnadsprover från mag-tarmkanalen hos PD-patienter8, och djurmodeller tyder på att alfa-synukleinaggregat i det enteriska nervsystemet sprider sig på ett prionliknande sätt till centrala nervsystemet9. Dessutom uppvisar PD-patienter avvikelser i tarmmikrobiomet10 och kan uppleva överdriven tarminflammation11. Förstoppning vid Parkinsons sjukdom har varit understuderad, med få rapporterade modeller av Parkinson-associerad förstoppning hos flugor12,13 eller gnagare14,15.
Denna analys använder en Drosophila-modell av PD där flugor uttrycker den mänskliga alfa-synuklein-genen under kontroll av en pan-neuronal drivrutin, n-synaptobrevin. Dessa flugor uppvisar alla kännetecken för PD, inklusive alfa-synukleinaggregation, motorisk dysfunktion och åldersrelaterad neurodegeneration, vilket resulterar i förlust av dopaminerga neuroner16,17. Tidigare studier har introducerat mätning av fekal produktion hos flugor för att bedöma tarmdysfunktion, kvantifiera flugavföring och jämföra avföringsmängder över olika genetiska linjer för att avslöja funktionella skillnader i matsmältningssystemet 18,19,20. Här demonstrerar vi förstoppningsanalysen med flugor som uttrycker humant alfa-synuklein. Detta enkla men värdefulla verktyg gör det möjligt att studera ett viktigt icke-motoriskt symtom på Parkinsons sjukdom.
Det finns flera steg i detta protokoll som kommer att hjälpa till att framgångsrikt slutföra analysen. För det första är det viktigt att se till att tidsintervallen mellan varje omgång för varje injektionsflaska är konsekventa under hela experimentet. Att märka injektionsflaskorna med siffror hjälper till att undvika behovet av långa genotypbeskrivningar, vilket sparar tid. Dessutom är det viktigt att metoden för att räkna avföring22 förblir konsekvent under hela experimentet. Medan blå avföring är synlig på maten och injektionsflaskans plugg, är färglös avföring inte det. Räkna därför inte de blå prickarna på mat- eller injektionsflaskans propp.
Med beteendeanalyser finns det alltid en möjlighet till inkonsekvenser i resultaten på grund av fluktuationer i flugans beteende eller okända variabler som påverkar analysen. Vi rekommenderar att du använder samma Drosophila-media , samma färgämne och samma märke av injektionsflaskor för alla experiment. Intressant nog har man i flera försök observerat att flugor tenderar att bajsa mindre ofta tidigt på eftermiddagen, möjligen på grund av flugornas dygnsrytm23. Detta beteende är dock konsekvent hos både kontrollflugor och flugor som uttrycker alfa-synuklein, så det bör inte ge upphov till problem.
Om flugorna inte utsöndrar blå avföring i början av analysen är det möjligt att det använda färgämnet inte är tillräckligt pigmenterat. I det här fallet kan man öka förhållandet mellan färgämne och destillerat vatten i enlighet med detta. Det är också möjligt att när det bara finns en liten mängd blå mat kvar i flugans matsmältningskanal kan det vara svårt att avgöra om avföringen är ljusblå eller färglös. När detta inträffar kan du placera ett vitt pappersark bakom injektionsflaskan för att bestämma färgen på avföringspricken. Även om avföringen är mycket ljusblå är det bäst att registrera den som blå avföring snarare än färglös avföring.
En begränsning med denna analys är att den kräver manuell räkning av fekala fläckar. För att förbättra potentialen för screening med hög kapacitet kan detta protokoll komma att modifieras i framtiden för att möjliggöra automatisk kvantifiering av blå fekala fläckar som produceras av enskilda flugor i plattor med flera brunnar. En annan begränsning är att, även om alfa-synukleinmodellen har potential att utvecklas till en prodromalmodell av PD, har en optimal tidpunkt vid vilken förstoppning är närvarande utan neurodegeneration ännu inte identifierats.
Sammanfattningsvis erbjuder denna metod ett enkelt och okomplicerat tillvägagångssätt för att modellera förstoppning, ett understuderat icke-motoriskt PD-symtom, i en Drosophila-modell av PD.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Mel Feany vid Brigham and Women’s Hospital och Harvard Medical School för den vänliga gåvan av kontroll och alfa-synuklein som uttrycker Drosophila-linjer . Vi erkänner följande källor till bidragsstöd till Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson’s Disease Early Investigator Award.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |