이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
사구체는 신장의 기본 단위입니다. 따라서 사구체를 연구하는 것은 신장 기능과 병리를 이해하는 데 중추적인 역할을 합니다. 생물학적 이미징은 직관적인 정보를 제공합니다. 따라서 사구체에 라벨을 붙이고 관찰하는 것은 매우 중요합니다. 그러나 현재 사용되고 있는 사구체 관찰 방법은 복잡한 조작이 필요하며, 그 결과 라벨 디테일이나 3차원(3D) 정보가 손실될 수 있습니다. 명확하고 방해받지 않는 뇌 영상 칵테일 및 컴퓨터 분석(CUBIC) 조직 투명화 기술은 신장 연구에서 널리 사용되어 보다 정확한 검출과 더 깊은 검출 깊이를 제공합니다. 우리는 중분자량 FITC-Dextran의 꼬리 정맥 주입 후 CUBIC clearing 방법으로 마우스 사구체를 빠르고 효과적으로 표지할 수 있음을 발견했습니다. 제거된 쥐의 신장은 광시트 현미경(또는 얇게 썬 경우 컨포칼 현미경)으로 스캔하여 전체 신장에 있는 모든 사구체의 3차원 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 적절한 소프트웨어로 처리하면 사구체 신호를 쉽게 디지털화하고 추가로 분석하여 사구체의 수, 부피 및 주파수를 측정할 수 있습니다.
서론
사구체의 수와 양은 다양한 신장 질환의 진단과 치료에 매우 중요하다 1,2,3,4,5. 사구체 수 추정의 황금 표준은 물리적 해부기/분획기 조합입니다. 그러나 이 방법은 특수 시약과 장비가 필요하므로 느리고 비용이 많이 듭니다 6,7,8,9. 생검은 풍부한 정보를 제공하지만, 분명히, 이 방법은 대략적인 추정치에만 적합하다10,11. 자기공명영상(MRI), 컴퓨터단층촬영(CT) 및 X-ray를 포함한 의료 영상 기술도 사구체 검출에 널리 사용되지만(12,13,14,15) 이러한 기술에는 부피가 큰 기구가 필요하다.
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프로토콜
이 연구에서는 성체 C57BL/6마리 마우스(생후 6주, 25-30g)를 사용했습니다. 모든 절차는 동물 복지 및 실험 윤리에 대한 현지 규정을 준수하여 수행되었습니다. 이 연구는 쓰촨 대학 생물 의학 연구 윤리 위원회의 중국 서부 병원의 승인을 받았습니다.
1. 사구체 표지 및 조직 준비
- 사구체 라벨링
- FITC-덱스트란(10mg)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 1:1(1mg: 1mL)의 비율로 녹여 작업 프로브 용액을 준비합니다.
알림: 작업 용액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다. - C57 마우스를 마우스 꼬리 정맥 고정 장치에 놓습니다. 거즈를 뜨거운 물로 적시고 거즈를 쥐꼬리 중간 부분에 감싼 후 꼬리를 1분 동안 따뜻하게 합니다.
- 왼쪽 및 오른쪽 꼬리 정맥이 보일 때까지 75% 에탄올로 마우스 꼬리를 닦습니다.
- 1mL 인슐린 주사기로 작업 프로브 용액 100μL를 뽑고 용액을 마우스 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다.
- 주입 후 프로브 용액을 30분 동안 순환시킵니다. 쥐가 새장에서 자유롭게 움직일 수 있도록 하십시오.
- 충분한 순환이 이루어지면 펜토바르비탈나트륨....
- FITC-덱스트란(10mg)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 1:1(1mg: 1mL)의 비율로 녹여 작업 프로브 용액을 준비합니다.
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결과
이 연구는 생쥐 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.
사구체(혈관)는 혈관 내 주입된 FITC-덱스트란에 의해 잘 표지될 수 있습니다. 투명화 과정 후 신장은 투명해졌고(그림 1A), 광시트 현미경(그림 1B) 또는 공초점 현미경(그림 1C)을 사용하여 사구체를 명확하게 관찰할 수 있었습니다. 컨포칼 현미경은 스캔 깊이가 제한되어 있으므로 신장은 약 1mm 두께의 조각으로 절단해야 합니다. 광시트 현미경을 사용하면 신장 전체를 직접 스캔할 수 있습니다.
명확한 신호로 사구체의 수를 쉽게 셀 수 있었습니다. 사실, 라벨링은 매우 효과적이어서 사구체를 육안으로 셀 수 있었습니다. 사구체의 부피도 직접 측정할 수 있습니다. 물론 Imari.......
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토론
조직 투명화 기술은 3개 또는 4개 그룹으로 분류할 수있다 29,30,31. 유기 용매 기반 조직 투명화(예: DISCO 및 PEGASOS), 수성 기반 조직 투명화(예: CUBIC) 및 하이드로겔 포매 조직 투명화(예: CLARITY)는 모두 신장 투명화에 적용되었습니다(25,26,28,32). CUBIC은 사구체(혈관)에 FITC-덱스트란이 부착되어 있을 때 가장 잘 작동합니다. 또한, CUBIC은 상대적으로 더 편리한 조작 공정을 가지며, 처리된 샘플이 유기 시약(33)에 담글 필요가 없기.......
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공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립자연과학재단(82204951)과 쓰촨성 과학기술프로그램(2020JDRC0102)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | 고정 reaagen |
| 502 접착제 | Deli | 7146 | 샘플 고정 어댑터에 신장을 고정하기 위해 |
| 안티피린 | 알라딘 | A110660 | 클리어링 시약 |
| 뇌 매트릭스 | RWD 생명 과학 | 1mm 40-75 | 조직 슬라이싱 |
| 컨포칼 현미경 | Nikon | A1plus | 이미지 획득 |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | 라벨링 시약 |
| 라이트 시트 형광 현미경 | 자이스 | 라이트 시트 7 | 이미지 획득 |
| 생쥐 | Ensiweier | 성체 C57BL/6 생쥐 (생후 6주, 25– 30g) | |
| N-부틸디에탄올아민 | 알라딘 | B299095 | 클리어링 시약 |
| 니코틴아미드 | 알라딘 | N105042 | 클리어링 시약 |
| 펜토바르비탈 나트리움잘츠 | 시그마-알드리치 | P3761 | |
| 꼬리 정맥 고정기 | JINUOTAI | JNT-FS35 | 베일 주입을 위한 마우스 고정 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 클리어링 시약 |
참고문헌
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Hum....
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