Primordial kimcelle kryopræservering og genoplivning af Drosophila stammer
Summary
En langsigtet konserveringsmetode for Drosophila-stammer som et alternativ til hyppig overførsel af voksne fluer til hætteglas med friske fødevarer er meget ønskelig. Denne protokol beskriver kryopræservering af Drosophila primordiale kimceller og stamme genoplivning via deres transplantation til agametiske værtsembryoner.
Abstract
Drosophila-stammer skal opretholdes ved hyppig overførsel af voksne fluer til nye hætteglas. Dette medfører en fare for mutationsforringelse og fænotypiske ændringer. Det er derfor bydende nødvendigt at udvikle en alternativ metode til langtidsbevaring uden sådanne ændringer. På trods af tidligere vellykkede forsøg er kryopræservering af Drosophila-embryoner stadig ikke til praktisk brug på grund af lav reproducerbarhed. Her beskriver vi en protokol for kryopræservering af primordiale kimceller (PGC) og genoplivning af stammer via transplantation af kryopræserverede PGC’er til agametiske Drosophila melanogaster (D. melanogaster) værtsembryoner. PGC’er er meget gennemtrængelige for kryoprotektive midler (CPA’er), og udviklingsmæssig og morfologisk variation blandt stammer er mindre problematisk end ved embryokryopræservering. I denne metode opsamles PGC’er fra ca. 30 donorembryoner, lægges i en nål efter CPA-behandling og kryopræserveres derefter i flydende nitrogen. For at producere donorafledte kønsceller optøs de kryopræserverede PGC’er i en nål og deponeres derefter i ca. 15 agametiske værtsembryoner. En frekvens på mindst 15% frugtbare fluer blev opnået med denne protokol, og antallet af afkom pr. frugtbart par var altid mere end nok til at genoplive den oprindelige stamme (det gennemsnitlige afkomstal var 77,2 ± 7,1), hvilket indikerer kryopræserverede PGC’ers evne til at blive kimlinjestamceller. Det gennemsnitlige antal fertile fluer pr. nål var 1,1 ± 0,2, og 9 ud af 26 nåle producerede to eller flere frugtbare afkom. Det blev konstateret, at 11 nåle er nok til at producere 6 eller flere afkom, hvor mindst en hun og en mand sandsynligvis er inkluderet. Den agametiske vært gør det muligt at genoplive stammen hurtigt ved blot at krydse nyopståede kvindelige og mandlige fluer. Derudover har PGC’er potentiale til at blive brugt i genteknologiske applikationer, såsom genomredigering.
Introduction
Vedligeholdelsen af Drosophila-stammer ved overførsel af voksne fluer til nye hætteglas resulterer uundgåeligt i akkumulering af mutationer og epigenetiske ændringer over tid. Udvikling af en alternativ metode til langsigtet vedligeholdelse af Drosophila-stammer uden sådanne ændringer er bydende nødvendig, især for referencestammer, hvor hele genomet skal opretholdes. Flere vellykkede forsøg på at kryopræservere Drosophila-embryoner eller æggestokke er blevet beskrevet 1,2,3. Desværre er de stadig ikke til praktisk brug på grund af lav reproducerbarhed. Faktisk har embryoner i tidlige stadier en lav overlevelsesrate efter kryopræservering på grund af deres høje indhold af æggeblommer, hvilket hæmmer gennemtrængning og diffusion af kryoprotektive midler (CPA) 2,3. CPA-permeabiliteten er også stærkt begrænset af de voksagtige lag af embryoner i sene stadier. Det er vanskeligt og tidskrævende at finde en stammespecifik tidsperiode, hvor embryoner har en høj overlevelsesrate og et tyndere vokslag. For nylig forbedrede Zhan et al.4 metoder til embryopermeabilisering, CPA-belastning og vitrifikation og med succes kryopræserverede embryoner af flere stammer. Metoderne er imidlertid ikke lette at anvende, fordi embryonernes levedygtighed efter permeabilisering har tendens til at være dårlig. Der er derfor stadig behov for yderligere forbedring og udvikling af alternative tilgange. Metoder, der involverer kryopræservering af primordiale kimceller (PGC’er), er en alternativ tilgang til langsigtet vedligeholdelse af Drosophila-stammer.
PGC (også kaldet polcelle) transplantation er blevet brugt til at generere kimlinjekimærer, især kvinder, til at studere processer som moderens virkninger af zygotiske dødelige mutationer og kønsbestemmelse af kimceller 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC’er er meget mindre end embryoner og vil sandsynligvis være meget gennemtrængelige for de fleste kryoprotektorer. Desuden er udviklingsmæssig og morfologisk variation blandt stammer mindre problematisk, og en agametisk vært muliggør hurtig gendannelse af hele genomer. Vi har for nylig udviklet en ny metode til PGC kryopræservering13, som forhindrer de ellers uundgåelige genetiske og epigenetiske ændringer i Drosophila-stammer. Her præsenterer vi den detaljerede protokol.
Denne kryopræserveringsmetode kræver særlig ekspertise inden for PGC-håndtering og instrumentering. Mens en trinvis tilgang kan være en effektiv løsning for dem, der ikke er bekendt med det, kan det være uegnet til små laboratorier på grund af instrumenteringskrav. Denne PGC-kryopræserveringsprotokol kan lettere tilpasses til brug med forskellige Drosophila-arter og forskellige insektarter end embryokryopræserveringsprotokoller på grund af mindre udviklingsmæssige og morfologiske forskelle. PGC’er kan også potentielt bruges i genteknologiske applikationer, såsom genomredigering 14,15,16. Sammenfattende kan denne metode bruges i lagercentre og andre laboratorier til at opretholde flue og andre insektstammer i længere perioder uden ændringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk faktor for succes i PGC kryopræservering og genoplivning er at bruge gode embryoner. Unge hunner (f.eks. 3 til 5 dage gamle) bør anvendes til embryoindsamling. Både donor- og værtsembryoner vurderes ved mikroskopisk inspektion, og kun embryoner på blastoderm-stadiet (stadium 5) anvendes12. Til PGC-indsamling justerer vi normalt ca. 40 donorembryoner i en periode på 20 minutter og indsamler PGC’er fra ca. 30 embryoner tidligt i fase 5; Ældre og defekte embryoner anvendes ikke. Eft…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker KYOTO Drosophila Stock Center for fluestammer. Vi takker også fru Wanda Miyata for engelsksproget redigering af manuskriptet og Dr. Jeremy Allen fra Edanz (https://jp.edanz.com/ac) for redigering af et udkast til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) til T.T.-S.-K., tilskud (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) fra AMED til S.K., et tilskud (JP20km0210172) fra AMED til T.T.-S.-K. og S.K., et tilskud til videnskabelig forskning (C) (JP19K06780) fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) til T.T.-S.-K. og et tilskud til videnskabelig forskning inden for innovative områder (JP18H05552) fra JSPS til S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. 유전학. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
