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생화학

Métabolomique artérioveineuse pour mesurer l’échange de métabolites in vivo dans le tissu adipeux brun

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

Dans ce protocole, les méthodes pertinentes pour la métabolomique artérioveineuse optimisée pour les MTD utilisant la GC-MS dans un modèle murin sont décrites. Ces méthodes permettent d’acquérir des informations précieuses sur l’échange de métabolites médié par les MTD au niveau de l’organisme.

Abstract

Le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle crucial dans la régulation de l’homéostasie métabolique grâce à un processus unique de dépense énergétique connu sous le nom de thermogenèse sans frisson. Pour y parvenir, BAT utilise un menu diversifié de nutriments circulants pour répondre à sa forte demande métabolique. De plus, la MTD sécrète des facteurs bioactifs dérivés de métabolites qui peuvent servir de carburants métaboliques ou de molécules de signalisation, facilitant la communication intratissulaire et/ou intertissulaire médiée par les MTD. Cela suggère que la MTD participe activement à l’échange systémique de métabolites, une caractéristique intéressante qui commence à être explorée. Ici, nous présentons un protocole pour la métabolomique artérioveineuse BAT optimisée in vivo au niveau de la souris. Le protocole se concentre sur des méthodes pertinentes pour les stimulations thermogéniques et une technique de prélèvement sanguin artérioveineux utilisant la veine de Sulzer, qui draine sélectivement le sang veineux interscapulaire dérivé de MTD et le sang artériel systémique. Ensuite, un protocole métabolomique basé sur la chromatographie en phase gazeuse utilisant ces échantillons de sang est démontré. L’utilisation de cette technique devrait permettre d’élargir la compréhension de l’échange de métabolites régulés par les MTD au niveau inter-organes en mesurant l’absorption et la libération nettes de métabolites par les MTD.

Introduction

Le tissu adipeux brun (MTD) possède une propriété unique de dépense énergétique connue sous le nom de thermogenèse sans frisson (NST), qui implique à la fois des mécanismes dépendants de la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1) et indépendants de l’UCP1 1,2,3,4,5. Ces caractéristiques distinctives impliquent la MTD dans la régulation du métabolisme systémique et la pathogenèse des maladies métaboliques, notamment l’obésité, le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la cachexie cancéreuse 6,7,8. Des études rétrospectives récentes ont montré une association inverse entre la masse MTD et/ou son activité métabolique avec l’obésité, l’hyperglycémie et la santé cardiométabolique chez l’homme 9,10,11.

Récemment, la MTD a été proposée comme un puits métabolique responsable du maintien de la NST, car elle nécessite des quantités substantielles de nutriments circulants comme carburant thermogénique 6,7. De plus, la MTD peut générer et libérer des facteurs bioactifs, appelés adipokines brunes ou BATokines, qui agissent comme des signaux endocriniens et/ou paracrines, indiquant son implication active dans l’homéostasie métabolique au niveau des systèmes 12,13,14,15. Par conséquent, la compréhension du métabolisme des nutriments de la MTD devrait améliorer notre compréhension de sa signification physiopathologique chez l’homme, au-delà de son rôle conventionnel en tant qu’organe thermorégulateur.

Des études métabolomiques utilisant des traceurs d’isotopes stables, en combinaison avec des études classiques d’absorption des nutriments utilisant des radiotraceurs non métabolisables, ont considérablement amélioré notre compréhension des nutriments qui sont préférentiellement absorbés par les MTD et de la manière dont ils sont utilisés 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Par exemple, des études de traceurs radioactifs ont démontré que les MTD activés par le froid absorbent le glucose, les acides gras liés aux lipoprotéines et les acides aminés à chaîne ramifiée 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Le traçage isotopique récent combiné à des études métabolomiques nous a permis de mesurer le devenir métabolique et le flux de ces nutriments dans les tissus et les cellules en culture 24,25,26,28,29,30. Cependant, ces analyses se concentrent principalement sur l’utilisation individuelle des nutriments, ce qui nous laisse avec une connaissance limitée des rôles systémiques des MTD dans l’échange de métabolites organiques. Les questions concernant la série spécifique de nutriments circulants consommés par les MTD et leurs contributions quantitatives en termes de carbone et d’azote restent insaisissables. De plus, l’exploration de la capacité de la MTD à générer et à libérer des BATokines dérivées de métabolites (par exemple, des lipokines) à l’aide de nutriments ne fait que commencer 12,13,14,15,31,32.

L’analyse sanguine artérioveineuse est une approche physiologique classique utilisée pour évaluer l’absorption ou la libération spécifique de molécules circulantes dans les organes/tissus. Cette technique a déjà été appliquée à la MTD interscapulaire de rats pour mesurer l’oxygène et plusieurs métabolites, établissant ainsi la MTD comme le site majeur de la thermogenèse adaptative avec son potentiel catabolique 33,34,35,36,37. Récemment, une étude artérioveineuse utilisant la MTD interscapulaire de rat a été couplée à une approche transomique, conduisant à l’identification de BATokines non découvertes libérées par la MTD38 stimulée thermiquement.

Les progrès récents de la métabolomique basée sur la chromatographie en phase gazeuse à haute sensibilité et la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (GC-MS et LC-MS) ont ravivé l’intérêt pour les études artérioveineuses pour l’analyse quantitative de l’échange de métabolites spécifiques à un organe 39,40,41. Ces techniques, avec leur pouvoir de résolution élevé et leur précision de masse, permettent l’analyse complète d’une large gamme de métabolites à partir de petites quantités d’échantillons.

Dans le cadre de ces avancées, une étude récente a réussi à adapter la métabolomique artérioveineuse à l’étude de la MTD au niveau de la souris, permettant l’analyse quantitative des activités d’échange de métabolites dans la MTD dans différentes conditions42. Cet article présente un protocole de métabolomique artérioveineuse ciblant les MTD en utilisant la GC-MS dans un modèle murin C57BL/6J.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Sungkyunkwan (IACUC). Les souris ont été hébergées dans une animalerie approuvée par l’IACUC, située dans une salle blanche réglée à 22 °C et 45 % d’humidité, après un cycle jour/lumière de 12 heures. Ils ont été gardés dans des racks ventilés et ont eu accès à un régime alimentaire standard ad libitum (comprenant 60 % de glucides, 16 % de protéi…

Representative Results

La figure 1 illustre le schéma expérimental de la métabolomique AV optimisée pour les MTD. Comme mentionné dans la section Protocole, pour obtenir des tissus adipeux bruns stimulés de manière différentielle, les souris subissent une acclimatation à la température à l’aide d’incubateurs pour rongeurs ou reçoivent une administration pharmacologique telle que des agonistes des récepteurs β-adrénergiques. Par la suite, les souris sont anesthésiées et des échantillons de san…

Discussion

Une étape essentielle pour comprendre le potentiel métabolique de la MTD dans l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps consiste à définir les nutriments qu’elle consomme, comment ils sont métaboliques et quels métabolites sont libérés dans la circulation. Ce protocole introduit une technique spécialisée de prélèvement artérioveineux qui permet d’accéder à la vascularisation veineuse de la MTD interscapulaire et à la vascularisation artérielle systémique chez les souris C57BL/6J, qui a ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions tous les membres des laboratoires Choi et Jung pour la discussion méthodologique. Nous remercions C. Jang et D. Guertin pour leurs conseils et leurs commentaires. Nous remercions M.S. Choi pour sa lecture critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés par NRF-2022R1C1C1012034 à S.M.J. ; NRF-2022R1C1C1007023 à D.W.C ; NRF-2022R1A4A3024551 à S.M.J. et D.W.C. Ce travail a été soutenu par l’Université nationale de Chungnam pour W.T.K. Figure 1 et Figure 2 ont été créées à l’aide de BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
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