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생화학

Metabolómica arteriovenosa para medir el intercambio de metabolitos in vivo en tejido adiposo marrón

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

En este protocolo, se describen los métodos relevantes para la metabolómica arteriovenosa optimizada para BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón. Estos métodos permiten la adquisición de información valiosa sobre el intercambio de metabolitos mediado por MTD a nivel de organismo.

Abstract

El tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la homeostasis metabólica a través de un proceso único de gasto de energía conocido como termogénesis sin escalofríos. Para lograr esto, BAT utiliza un menú diverso de nutrientes circulantes para respaldar su alta demanda metabólica. Además, las MTD secretan factores bioactivos derivados de metabolitos que pueden servir como combustibles metabólicos o moléculas de señalización, lo que facilita la comunicación intratisular y/o intertisular mediada por BAT. Esto sugiere que las MTD participan activamente en el intercambio sistémico de metabolitos, una característica interesante que está empezando a ser explorada. Aquí, presentamos un protocolo para la metabolómica arteriovenosa de MTD optimizada in vivo a nivel de ratón. El protocolo se centra en métodos relevantes para las estimulaciones termogénicas y una técnica de muestreo de sangre arteriovenosa utilizando la vena de Sulzer, que drena selectivamente la sangre venosa derivada de BAT interescapular y la sangre arterial sistémica. A continuación, se demuestra un protocolo metabolómico basado en cromatografía de gases utilizando esas muestras de sangre. El uso de esta técnica debería ampliar la comprensión del intercambio de metabolitos regulado por MTD a nivel interorgánico mediante la medición de la absorción y liberación neta de metabolitos por las MTD.

Introduction

El tejido adiposo marrón (BAT) posee una propiedad única de gasto energético conocida como termogénesis sin temblores (NST), que involucra mecanismos dependientes de la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1) e independientes de UCP1 1,2,3,4,5. Estas características distintivas implican a las MTD en la regulación del metabolismo sistémico y la patogénesis de las enfermedades metabólicas, como la obesidad, la diabetes tipo 2, las enfermedades cardiovasculares y la caquexia por cáncer 6,7,8. Estudios retrospectivos recientes han demostrado una asociación inversa entre la masa MTD y/o su actividad metabólica con la obesidad, la hiperglucemia y la salud cardiometabólica en humanos 9,10,11.

Recientemente, la MTD ha sido propuesta como un sumidero metabólico responsable del mantenimiento de la TSN, ya que requiere cantidades sustanciales de nutrientes circulantes como combustible termogénico 6,7. Además, la MTD puede generar y liberar factores bioactivos, denominados adipocinas marrones o BATokinas, que actúan como señales endocrinas y/o paracrinas, lo que indica su participación activa en la homeostasis metabólica a nivel de sistemas 12,13,14,15. Por lo tanto, comprender el metabolismo de los nutrientes de BAT debería mejorar nuestra comprensión de su importancia fisiopatológica en los seres humanos, más allá de su papel convencional como órgano termorregulador.

Los estudios metabolómicos en los que se emplean trazadores de isótopos estables, en combinación con los estudios clásicos de absorción de nutrientes en los que se utilizan radiotrazadores no metabolizables, han mejorado significativamente nuestra comprensión de qué nutrientes son absorbidos preferentemente por las MTD y cómo se utilizan 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por ejemplo, los estudios de trazadores radiactivos han demostrado que la MTD activada por frío absorbe glucosa, ácidos grasos unidos a lipoproteínas y aminoácidos de cadena ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27. El rastreo de isótopos reciente combinado con estudios metabolómicos nos ha permitido medir el destino metabólico y el flujo de estos nutrientes dentro de los tejidos y células cultivadas 24,25,26,28,29,30. Sin embargo, estos análisis se centran principalmente en la utilización individual de nutrientes, lo que nos deja con un conocimiento limitado de las funciones de los sistemas BAT en el intercambio de metabolitos de órganos. Las cuestiones relativas a la serie específica de nutrientes circulantes consumidos por las MTD y sus contribuciones cuantitativas en términos de carbono y nitrógeno siguen siendo difíciles de alcanzar. Además, la exploración de si las MTD pueden generar y liberar BATokines derivadas de metabolitos (por ejemplo, lipocinas) utilizando nutrientesapenas está comenzando 12,13,14,15,31,32.

El análisis de sangre arteriovenosa es un enfoque fisiológico clásico que se utiliza para evaluar la captación o liberación específica de moléculas circulantes en órganos/tejidos. Esta técnica se ha aplicado previamente a la MTD interescapular de ratas para medir el oxígeno y varios metabolitos, estableciendo así la MTD como el principal sitio de termogénesis adaptativa con su potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recientemente, un estudio arteriovenoso en el que se utilizaron MTD interescapulares de rata se combinó con un enfoque transómico, lo que condujo a la identificación de BATokines no descubiertos liberados por la MTD38 estimulada termogénicamente.

Los avances recientes en la metabolómica basada en cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta sensibilidad basada en espectrometría de masas (GC-MS y LC-MS) han reavivado el interés en los estudios arteriovenosos para el análisis cuantitativo del intercambio de metabolitos específicos de órganos 39,40,41. Estas técnicas, con su alto poder de resolución y precisión de masa, permiten el análisis exhaustivo de una amplia gama de metabolitos utilizando pequeñas cantidades de muestra.

En consonancia con estos avances, un estudio reciente adaptó con éxito la metabolómica arteriovenosa para estudiar las MTD a nivel de ratón, lo que permitió el análisis cuantitativo de las actividades de intercambio de metabolitos en las MTD en diferentes condiciones42. En este artículo se presenta un protocolo de metabolómica arteriovenosa dirigido a BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón C57BL/6J.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan. Los ratones se alojaron en una instalación de animales aprobada por la IACUC ubicada en una sala limpia a 22 °C y 45% de humedad, siguiendo un ciclo diario de luz/oscuridad de 12 h. Se mantuvieron en estantes ventilados y tuvieron acceso a una dieta estándar de comida ad libitum (que comprendía 60% de carbohidratos, 16% de proteínas y 3% de grasas). La ropa de…

Representative Results

La Figura 1 ilustra el esquema experimental de la metabolómica AV optimizada para BAT. Como se mencionó en la sección de Protocolo, para obtener tejidos adiposos marrones estimulados diferencialmente, los ratones se someten a aclimatación a la temperatura utilizando incubadoras de roedores o reciben administración farmacológica como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, los ratones son anestesiados y se recogen muestras de sangre para su análisis metabolómico (<st…

Discussion

Un paso crítico para comprender el potencial metabólico de las MTD en el equilibrio energético de todo el cuerpo es definir qué nutrientes consume, cómo se procesan metabólicamente y qué metabolitos se liberan en la circulación. Este protocolo introduce una técnica especializada de muestreo arteriovenoso que permite el acceso a la vasculatura venosa de la MTD interescapular y a la vasculatura arterial sistémica en ratones C57BL/6J, que fue desarrollada y validada recientemente por Park et al42…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros de los laboratorios Choi y Jung por la discusión metodológica. Agradecemos a C. Jang y D. Guertin por sus consejos y comentarios. Agradecemos a M.S. Choi por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por NRF-2022R1C1C1012034 a S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 a D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 a S.M.J. y D.W.C. Este trabajo fue apoyado por la Universidad Nacional de Chungnam para W.T.K. La Figura 1 y la Figura 2 se crearon utilizando BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
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