JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Arteriovenös metabolomik för att mäta in vivo metabolitutbyte i brun fettvävnad

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

I detta protokoll beskrivs metoder som är relevanta för BAT-optimerad arteriovenös metabolomik med GC-MS i en musmodell. Dessa metoder gör det möjligt att få värdefulla insikter om BAT-medierat metabolitutbyte på organismnivå.

Abstract

Brun fettvävnad (BAT) spelar en avgörande roll för att reglera metabolisk homeostas genom en unik energiförbrukningsprocess som kallas icke-skakande termogenes. För att uppnå detta använder BAT en varierad meny av cirkulerande näringsämnen för att stödja sitt höga metaboliska behov. BAT utsöndrar dessutom bioaktiva faktorer som härrör från metaboliter och som kan fungera som antingen metaboliska bränslen eller signalmolekyler, vilket underlättar BAT-medierad kommunikation inom och/eller mellan vävnader. Detta tyder på att BAT aktivt deltar i det systemiska metabolitutbytet, en intressant egenskap som börjar utforskas. Här introducerar vi ett protokoll för in vivo optimerad BAT arteriovenös metabolomik på musnivå. Protokollet fokuserar på relevanta metoder för termogena stimuleringar och en arteriovenös blodprovstagningsteknik med hjälp av Sulzers ven, som selektivt dränerar interscapular BAT-härlett venöst blod och systemiskt arteriellt blod. Därefter demonstreras ett gaskromatografibaserat metabolomikprotokoll med hjälp av dessa blodprover. Användningen av denna teknik bör öka förståelsen av BAT-reglerat metabolitutbyte mellan organ genom att mäta nettoupptag och frisättning av metaboliter genom BAT.

Introduction

Brun fettvävnad (BAT) har en unik energiförbrukningsegenskap som kallas icke-skakande termogenes (NST), som involverar både mitokondriellt frikopplingsprotein 1 (UCP1)-beroende och UCP1-oberoende mekanismer 1,2,3,4,5. Dessa särdrag innebär att BAT är inblandad i regleringen av systemisk metabolism och patogenesen av metabola sjukdomar, inklusive fetma, typ 2-diabetes, hjärt-kärlsjukdom och cancerkakexi 6,7,8. Nyligen genomförda retrospektiva studier har visat ett omvänt samband mellan BAT-massa och/eller dess metaboliska aktivitet med fetma, hyperglykemi och kardiometabol hälsa hos människor 9,10,11.

På senare tid har BAT föreslagits som en metabolisk sänka som ansvarar för att upprätthålla NST, eftersom den kräver betydande mängder cirkulerande näringsämnen som termogen bränsle6,7. BAT kan dessutom generera och frigöra bioaktiva faktorer, så kallade bruna adipokiner eller BATokiner, som fungerar som endokrina och/eller parakrina signaler, vilket indikerar dess aktiva inblandning i metabolisk homeostas på systemnivå 12,13,14,15. Att förstå BAT:s näringsmetabolism bör därför öka vår förståelse för dess patofysiologiska betydelse hos människor, utöver dess konventionella roll som ett termoreglerande organ.

Metabolomikstudier med stabila isotopspårämnen, i kombination med klassiska studier av näringsupptag med icke-metaboliserbara radioaktiva spårämnen, har avsevärt förbättrat vår förståelse av vilka näringsämnen som företrädesvis tas upp av BAT och hur de utnyttjas 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Studier av radioaktiva spårämnen har till exempel visat att köldaktiverad BAT tar upp glukos, lipoproteinbundna fettsyror och grenade aminosyror 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Nyligen genomförd isotopspårning i kombination med metabolomiska studier har gjort det möjligt för oss att mäta det metaboliska ödet och flödet av dessa näringsämnen i vävnader och odlade celler 24,25,26,28,29,30. Dessa analyser fokuserar dock främst på det individuella utnyttjandet av näringsämnen, vilket ger oss begränsad kunskap om BAT:s roll på systemnivå i organmetabolitutbytet. Frågor om den specifika serie av cirkulerande näringsämnen som förbrukas av bästa tillgängliga teknik och deras kvantitativa bidrag i form av kol och kväve är fortfarande svårfångade. Dessutom har undersökningen av huruvida BAT kan generera och frisätta metabolithärledda BATokiner (t.ex. lipokiner) med hjälp av näringsämnen precis börjat 12,13,14,15,31,32.

Arteriovenös blodanalys är en klassisk fysiologisk metod som används för att bedöma det specifika upptaget eller frisättningen av cirkulerande molekyler i organ/vävnader. Denna teknik har tidigare tillämpats på den interscapulära BAT hos råttor för att mäta syre och flera metaboliter, och därigenom etablera BAT som den viktigaste platsen för adaptiv termogenes med dess katabola potential 33,34,35,36,37. Nyligen kombinerades en arteriovenös studie med interscapulär BAT på råtta med en trans-omics-metod, vilket ledde till identifiering av oupptäckta BATokiner som frigörs av termogent stimulerad BAT38.

De senaste framstegen inom högkänslig gaskromatografi- och vätskekromatografi-masspektrometri (GC-MS och LC-MS)-baserad metabolomik har återuppväckt intresset för arteriovenösa studier för kvantitativ analys av organspecifikt metabolitutbyte 39,40,41. Dessa tekniker, med sin höga upplösningsförmåga och massnoggrannhet, möjliggör omfattande analys av ett brett spektrum av metaboliter med hjälp av små provmängder.

I linje med dessa framsteg har man i en nyligen genomförd studie framgångsrikt anpassat arteriovenös metabolomik för att studera BAT på musnivå, vilket möjliggör kvantitativ analys av metabolitutbytesaktiviteter i BAT under olika förhållanden42. Den här artikeln presenterar ett BAT-riktat arteriovenöst metabolomikprotokoll med GC-MS i en C57BL/6J-musmodell.

Protocol

Alla experiment utfördes med godkännande av Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Mössen inhystes i en IACUC-godkänd djuranläggning i ett renrum med en luftfuktighet på 22 °C och 45 % luftfuktighet, efter en daglig 12 timmars ljus/mörker-cykel. De hölls i ventilerade ställningar och hade tillgång till en standarddiet ad libitum (bestående av 60 % kolhydrater, 16 % protein och 3 % fett). Strö och bomaterial byttes ut varje vecka. För denna studie användes manliga C57BL…

Representative Results

Figur 1 illustrerar det experimentella schemat för BAT-optimerad AV-metabolomik. Som nämnts i protokollavsnittet, för att erhålla differentiellt stimulerad brun fettvävnad, genomgår möss temperaturacklimatisering med hjälp av gnagarinkubatorer eller får farmakologisk administrering såsom β-adrenerga receptoragonister. Därefter sövs möss och blodprover samlas in för metabolomisk analys (Figur 1A). Vid blodprovstagning samlas venöst blod som dräne…

Discussion

Ett viktigt steg för att förstå BAT:s metaboliska potential i hela kroppens energibalans är att definiera vilka näringsämnen den konsumerar, hur de metaboliskt bearbetas och vilka metaboliter som släpps ut i cirkulationen. Detta protokoll introducerar en specialiserad arteriovenös provtagningsteknik som möjliggör tillgång till den venösa vaskulaturen av interscapular BAT och systemisk arteriell vaskulatur i C57BL/6J-möss, som nyligen utvecklades och validerades av Park et al42. Nedan …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar alla medlemmar i Choi- och Jung-laboratorierna för metodologiska diskussioner. Vi tackar C. Jang och D. Guertin för råd och feedback. Vi tackar M.S. Choi för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete finansierades av NRF-2022R1C1C1012034 till S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 till D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 till S.M.J. och D.W.C. Detta arbete stöddes av Chungnam National University för W.T.K. Figur 1 och Figur 2 skapades med hjälp av BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes – ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5′-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man’s adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Tags

Arteriovenous MetabolomicsMetabolite ExchangeEnergy ExpenditureThermogenesisMouse ModelGas Chromatography-based Metabolomics
check_url/kr/66012?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image