在这里,我们描述了一种用于大规模生产内体衍生纳米囊泡的磁分离辅助高速均质化方法,作为一种新型的外泌体模拟物 (EM),它们具有相同的生物学起源和相似的结构、形态和蛋白质组成天然细胞外囊泡 (EVs)。
细胞外囊泡(EVs)在生理病理研究、疾病诊断和治疗中备受关注;然而,由于缺乏放大生产方法,它们的临床转化受到限制。因此,该协议为大规模生产内体衍生的纳米囊泡提供了一种磁分离辅助的高速均质化方法,作为一种源自内体的新型外泌体模拟物(EMs),其产率比传统的超速离心方法高出约100倍。在这种方法中,磁性纳米颗粒(MNPs)通过内吞作用被亲本细胞内化,随后在其内体中积累。然后,收集负载MNPs的内体,并通过低渗处理和磁分离进行纯化。使用高速均质器将负载MNP的内体分解成单分散的纳米囊泡。由此产生的内体衍生囊泡具有相同的生物起源和结构,其特征是纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和蛋白质印迹。它们的形态和蛋白质组成与天然 EV 相似,表明 EM 可能作为天然 EV 的低成本和高产量替代品,用于临床转化。
细胞外囊泡 (EV) 是几乎所有细胞分泌的小囊泡,大小范围为 30-150 nm,含有丰富的生物活性物质。根据来源细胞的不同,EV 表现出高度异质性,具有亲本细胞特异性的多种成分1。EV 被释放到体液中并运输到远处,在那里它们被靶细胞吸收以发挥作用2,可用于递送用于组织修复、肿瘤诊断和治疗以及免疫调节的各种生物活性分子和药物 3,4。然而,体液中具有相似生物物理特性的其他生物纳米颗粒(例如脂蛋白)和纳米囊泡(例如,来自非内体途径的 EV)不可避免地会影响 EV 的分离和纯化。迄今为止,超速离心仍然是 EV 分离的金标准,并且已经开发了其他分离方法,包括蔗糖密度梯度离心、超滤、聚乙二醇沉淀、色谱和免疫磁珠分离5。目前限制 EV 疗法临床转化和商业化的瓶颈是严重缺乏能够实现 EV 高度可扩展和可重复分离的分离技术 6,7,8。传统的EV分离技术(如超速离心和尺寸排阻色谱)产量低(1 x 107-1 x 108/1 x 106个细胞)、生产周期长(24-48 h)、产品质量重现性差,需要昂贵且能源密集型的生产设备,无法满足目前对EV的临床需求6。
外泌体模拟物 (EM) 是天然电动汽车的合成替代品,由于它们在生产中的结构、功能和可扩展性高度相似,因此引起了人们的广泛关注。EM 的主要来源是连续切片的整个亲本细胞的直接挤出 9,10,显示出作为天然 EV 的强大生物学功能11,12。例如,源自人脐带间充质干细胞 (hUCMSCs) 的 EM 具有与天然 EV 相似的伤口愈合作用,并且蛋白质组成更丰富13。虽然来自全细胞的EM具有EV的生物学复杂性,但它们的主要缺点是产物的异质性,因为它们不可避免地受到各种细胞器和细胞碎片的污染。蛋白质定位分析进一步表明,源自全细胞挤出的 EM 含有许多来自线粒体和内质网的非 EVs 特异性蛋白质13。此外,大多数制造电磁镜的方法仍然需要超速离心,这是一个非常耗时和耗能的过程14。考虑到外泌体完全来源于细胞内体这一事实,我们假设与全细胞挤出方法产生的成熟细胞膜衍生的 EM 相比,生物工程内体衍生的纳米囊泡可能更好地概括外泌体和 EM 之间的生物学同源性14。然而,由于缺乏可行的方法,内体衍生的纳米囊泡的制造是困难的。
临床研究是利用EV作为无细胞疗法的替代品和用于治疗各种疾病的纳米级药物递送系统进行的。例如,源自骨髓间充质干细胞的 EV 已被用于治疗由 COVID-19 引起的严重肺炎,并取得了可喜的结果。最近,携带 CD24 蛋白的基因工程 EV 也显示出治疗 COVID-19 患者的有效治疗效果15,16。然而,由于产量低、成本低,传统分离方法仍无法满足EV治疗的临床需求。本研究报道了通过磁分离辅助高速均质化方法大规模生产内体衍生的纳米囊泡。它利用MNPs的内吞途径,通过磁分离分离MNP负载的内体,然后进行高速匀浆,将内体配制成单分散的纳米囊泡。由于该协议收集的内体类型多种多样,因此仍需要进一步深入研究以建立行业内的良好生产规范(GMP)。这种新颖的EM制备方法更省时(5分钟的高速均质化),以获得与天然EV同源的纳米囊泡。与超速离心相比,它从相同数量的细胞中产生更多的囊泡,超速离心通常可以应用于各种细胞类型。
作为无细胞疗法和纳米级药物递送系统的替代品,EV尚未达到其临床预期,主要障碍是缺乏可扩展和可重复的生产和纯化方法6。因此,各种类型的 EM 已被开发为具有相似生物复杂性的 EV 类似物14。迄今为止,最常用的EM例子是细胞质膜衍生的纳米囊泡。通过直接挤出整个母体细胞17,这种纳米囊泡的制备相对容易和直接。然而,由于两个缺点?…
The authors have nothing to disclose.
作者承认在中国科学院基础医学与肿瘤研究所(IBMC)的共享仪器核心设施中使用仪器。本研究得到了国家自然科学基金(NSFC;82172598)、浙江省自然科学基金(LZ22H310001)、浙江省卫生健康委员会551卫生人才培养项目、杭州市科技局农业与社会发展研究项目(2022ZDSJ0474)和钱塘交叉学科研究基金的资助。
Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |