En magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode til storskala produktion af endosomafledte vesikler

Summary

Her beskriver vi en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode til storskala produktion af endosomafledte nanovesikler som en ny type exosomefterligninger (EM’er), der deler samme biologiske oprindelse og lignende struktur, morfologi og proteinsammensætning af native ekstracellulære vesikler (EV’er).

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV’er) har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed i fysiologisk og patologisk forskning, sygdomsdiagnose og behandling; Deres kliniske oversættelse har imidlertid været begrænset af manglen på opskaleringsfremstillingsmetoder. Derfor tilvejebringer denne protokol en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode til storskala produktion af endosomafledte nanovesikler som en ny type exosomefterligninger (EM’er) afledt af endosomerne, som har ca. 100 gange højere udbytte end konventionel ultracentrifugeringsmetode. I denne metode blev magnetiske nanopartikler (MNP’er) internaliseret af forældreceller via endocytose og blev efterfølgende akkumuleret i deres endosomer. Derefter blev MNP-belastede endosomer opsamlet og renset ved hypotonisk behandling og magnetisk adskillelse. En højhastighedshomogenisator blev brugt til at bryde MNP-belastede endosomer i monodisperse nanovesikler. De resulterende endosomafledte vesikler har samme biologiske oprindelse og struktur, kendetegnet ved nanopartikelsporingsanalyse, transmissionselektronmikroskop og western blotting. Deres morfologi og proteinsammensætning ligner native EV’er, hvilket indikerer, at EM’er potentielt kan tjene som en billig og højtydende surrogat af native EV’er til kliniske oversættelser.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV’er) er små vesikler udskilt af næsten alle celler med et størrelsesområde på 30-150 nm, der indeholder rigelige bioaktive stoffer. Afhængigt af oprindelsescellen viser EV’er høj heterogenitet og besidder flere komponenter, der er specifikke for moderceller¹. EV’er frigives i kropsvæsker og transporteres til fjerne steder, hvor de optages af målceller til handling², som kan bruges til at levere en bred vifte af bioaktive molekyler og lægemidler til vævsreparation, tumordiagnose og -behandling og immunmodulation ^3,4. Imidlertid påvirker andre biologiske nanopartikler (f.eks. lipoproteiner) og nanovesikler (f.eks. EV’er afledt af ikke-endosomale veje) med lignende biofysiske egenskaber i kropsvæsker uundgåeligt EV-isolering og oprensning. Til dato forbliver ultracentrifugering guldstandarden for EV-isolering, og andre isolationsmetoder, herunder centrifugering af saccharosedensitetsgradient, ultrafiltrering, polyethylenglycoludfældning, kromatografi og immunomagnetisk perleisolering, er blevet udviklet⁵. Den nuværende flaskehals, der begrænser klinisk oversættelse og kommercialisering af EV-terapi, er den alvorlige mangel på isolationsteknikker, der muliggør meget skalerbar og reproducerbar isolering af EV’er ^6,7,8. Traditionelle EV-isolationsteknikker (f.eks. ultracentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi) lider under lavt udbytte (1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10 6 celler), lang produktionscyklus (24-48 timer), dårlig reproducerbarhed af produktkvalitet og kræver dyrt og energiintensivt produktionsudstyr, der ikke kan imødekomme den nuværende kliniske efterspørgsel efter elbiler⁶.

Exosomefterligninger (EM’er), syntetiske surrogater af indfødte elbiler, har tiltrukket sig vigtig opmærksomhed på grund af deres meget lignende struktur, funktion og skalerbarhed i produktionen. Hovedkilden til EM’er er fra direkte ekstrudering af hele forældreceller med kontinuerlig sektionering^9,10, hvilket demonstrerer potente biologiske funktioner som native EV’er^11,12. For eksempel udøver EM’er afledt af humane navlesnorsmesenkymale stamceller (hUCMSC’er) lignende sårhelende virkninger som indfødte EV’er og er rigere på proteinsammensætning¹³. Selvom EM’er afledt af hele celler har den biologiske kompleksitet af EV’er, er deres største ulempe heterogeniteten af produkter, fordi de uundgåeligt er forurenet af forskellige cellulære organeller og celleaffald. Proteinlokaliseringsanalyse afslørede yderligere, at EM’er afledt af helcelleekstrudering indeholder mange ikke-EVs-specifikke proteiner fra mitokondrier og det endoplasmatiske retikulum¹³. Desuden kræver de fleste metoder til fremstilling af EM’er stadig ultracentrifugering, en meget tidskrævende og energiforbrugende proces¹⁴. I betragtning af det faktum, at exosomer udelukkende stammer fra cellulære endosomer, antog vi, at biomanipulerede endosomafledte nanovesikler bedre kan rekapitulere den biologiske homologi mellem exosomer og EM’er sammenlignet med de veletablerede cellemembranafledte EM’er produceret ved helcelleekstruderingsmetode¹⁴. Ikke desto mindre er fremstillingen af nanovesikler afledt af endosom vanskelig på grund af manglen på levedygtige tilgange.

Kliniske undersøgelser er blevet udført ved at bruge EV’er som en surrogat af cellefri terapi og et nanoskala lægemiddelafgivelsessystem til behandling af forskellige sygdomme. For eksempel er elbiler afledt af mesenkymale stamceller fra knoglemarv blevet brugt til behandling af alvorlig lungebetændelse forårsaget af COVID-19 og har opnået lovende resultater. For nylig har genetisk manipulerede elbiler, der bærer CD24-proteiner, også vist potente terapeutiske fordele til behandling af COVID-19-patienter^15,16. Imidlertid kan det kliniske krav til EV-terapi stadig ikke opfyldes med traditionelle isolationsmetoder på grund af det lave udbytte og omkostninger. Denne undersøgelse rapporterer storskala produktion af endosomafledte nanovesikler via en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode. Det udnytter endocytosevejen for MNP’er til at isolere MNP-belastede endosomer via magnetisk adskillelse efterfulgt af højhastighedshomogenisering for at formulere endosomer i monodisperse nanovesikler. Da de typer endosomer, der indsamles af denne protokol, er forskellige, er der stadig behov for yderligere dybdegående forskning for at etablere god fremstillingspraksis (GMP) i branchen. Denne nye EM-forberedelsesmetode er mere tidseffektiv (5 minutters højhastighedshomogenisering) for at opnå nanovesikler, der er homologe med native EV’er. Det producerer eksponentielt flere vesikler fra de samme mængder celler end ultracentrifugering, som generelt kan anvendes på forskellige celletyper.

Protocol

BEMÆRK: Et skema over metoden er vist i figur 1. 1. EM-forberedelse og isolering Celleinternalisering af MNP’erCellekulturSuspender 1 × 106 mesenkymale stamceller fra knoglemarv hos rotter (BMSC), 293T-celler eller musens ovarieepitelcancerceller (ID8) i DMEM komplet medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 5% penicillin-streptomycinopløsning (P / S) i 2 ml pr. Seks-brøndplade (se materialetabel…

Representative Results

Arbejdsprocessen for EM-forberedelse ved magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogenisering er vist i figur 1. Celler internaliserer 10 nm polylysinmodificerede IONP’er, som specifikt akkumuleres i endosomer via endocytose (figur 3A). Efter behandling med hypotonisk buffer og homogeniseret frigives de IONP-belastede endosomer fra cellerne og opsamles efterfølgende ved magnetisk adskillelse. De isolerede endosomer rekonstitueres yderligere til monodisp…

Discussion

Som et surrogat for cellefri terapi og et nanoskala lægemiddelafgivelsessystem har elbiler endnu ikke opfyldt deres kliniske forventninger, og en hovedhindring er manglen på skalerbare og reproducerbare produktions- og oprensningsmetoder⁶. Derfor er forskellige typer EM’er blevet udviklet som EV-analoger med lignende biologisk kompleksitet¹⁴. Til dato er det mest almindeligt anvendte EM-eksempel celleplasmamembranafledte nanovesikler. Fremstillingen af sådanne nanovesikl…

Materials

Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis