Een magnetische scheidings-ondersteunde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide blaasjes
Summary
Hier beschrijven we een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM’s) die dezelfde biologische oorsprong en vergelijkbare structuur, morfologie en eiwitsamenstelling van inheemse extracellulaire blaasjes (EV’s) delen.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) hebben veel aandacht getrokken in fysiologisch en pathologisch onderzoek, ziektediagnose en behandeling; Hun klinische vertaling is echter beperkt door het gebrek aan opschalingsbenaderingen. Daarom biedt dit protocol een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor de grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM’s) afgeleid van de endosomen, die ongeveer 100 keer hogere opbrengst hebben dan conventionele ultracentrifugatiemethode. Bij deze methode werden magnetische nanodeeltjes (MNP’s) geïnternaliseerd door oudercellen via endocytose en vervolgens geaccumuleerd in hun endosomen. Vervolgens werden met MNP’s geladen endosomen verzameld en gezuiverd door hypotone behandeling en magnetische scheiding. Een hogesnelheidshomogenisator werd gebruikt om MNP-geladen endosomen te breken in monodisperse nanovesikels. De resulterende endosoom-afgeleide blaasjes hebben dezelfde biologische oorsprong en structuur, gekenmerkt door nanodeeltjesvolganalyse, transmissie-elektronenmicroscoop en westernvlekken. Hun morfologie en eiwitsamenstelling zijn vergelijkbaar met native EV’s, wat aangeeft dat EM’s mogelijk kunnen dienen als een goedkoop en hoogrenderend surrogaat van native EV’s voor klinische vertalingen.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn kleine blaasjes die door bijna alle cellen worden uitgescheiden met een groottebereik van 30-150 nm en die overvloedige bioactieve stoffen bevatten. Afhankelijk van de cel van oorsprong vertonen EV’s een hoge heterogeniteit, met meerdere componenten die specifiek zijn voor oudercellen1. EV’s komen vrij in lichaamsvloeistoffen en worden naar verre locaties getransporteerd waar ze door doelcellen worden opgenomen voor actie2, die kan worden gebruikt om een breed scala aan bioactieve moleculen en medicijnen af te leveren voor weefselherstel, tumordiagnose en -behandeling en immuunmodulatie 3,4. Andere biologische nanodeeltjes (bijv. lipoproteïnen) en nanovesikels (bijv. EV’s afgeleid van niet-endosomale routes) met vergelijkbare biofysische eigenschappen in lichaamsvloeistoffen beïnvloeden echter onvermijdelijk de isolatie en zuivering van EV. Tot op heden blijft ultracentrifugatie de gouden standaard voor EV-isolatie en zijn er andere isolatiemethodenontwikkeld, waaronder centrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt, ultrafiltratie, polyethyleenglycolprecipitatie, chromatografie en isolatie van immunomagnetische parels5. Het huidige knelpunt dat de klinische vertaling en commercialisering van EV-therapieën beperkt, is het ernstige gebrek aan isolatietechnieken die een zeer schaalbare en reproduceerbare isolatie van EV’s mogelijk maken 6,7,8. Traditionele EV-isolatietechnieken (bijv. ultracentrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie) hebben te kampen met een laag rendement (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 cellen), een lange productiecyclus (24-48 uur), een slechte reproduceerbaarheid van de productkwaliteit en vereisen dure en energie-intensieve productieapparatuur die niet kan voldoen aan de huidige klinische vraag naar EV’s6.
Exosoomnabootsers (EM’s), synthetische surrogaten van native EV’s, hebben belangrijke aandacht getrokken vanwege hun zeer vergelijkbare structuur, functie en schaalbaarheid in de productie. De belangrijkste bron van EM’s is de directe extrusie van hele oudercellen met continue doorsnede9,10, wat krachtige biologische functies aantoont als native EV’s11,12. EM’s afgeleid van mesenchymale stamcellen van de menselijke navelstreng (hUCMSC’s) oefenen bijvoorbeeld vergelijkbare wondgenezende effecten uit als native EV’s en zijn rijker aan eiwitsamenstelling13. Hoewel EM’s afkomstig van hele cellen de biologische complexiteit van EV’s hebben, is hun belangrijkste nadeel de heterogeniteit van producten omdat ze onvermijdelijk besmet zijn door verschillende cellulaire organellen en celresten. Eiwitlokalisatieanalyse toonde verder aan dat EM’s afgeleid van extrusie van hele cellen veel niet-EVs-specifieke eiwitten uit mitochondriën en het endoplasmatisch reticulumbevatten 13. Bovendien vereisen de meeste methoden voor de productie van EM’s nog steeds ultracentrifugatie, een zeer tijdrovend en energieverslindend proces14. Gezien het feit dat exosomen uitsluitend zijn afgeleid van cellulaire endosomen, veronderstelden we dat bio-gemanipuleerde endosoom-afgeleide nanovesikels de biologische homologie tussen exosomen en EM’s beter kunnen samenvatten in vergelijking met de gevestigde celmembraan-afgeleide EM’s geproduceerd door extrusiemethode van hele cellen14. Desalniettemin is de productie van van endosoom afgeleide nanoblaasjes moeilijk vanwege het gebrek aan levensvatbare benaderingen.
Klinische studies zijn uitgevoerd door EV’s te gebruiken als surrogaat van celvrije therapie en een medicijnafgiftesysteem op nanoschaal voor de behandeling van verschillende ziekten. EV’s afgeleid van mesenchymale stamcellen in het beenmerg zijn bijvoorbeeld gebruikt om ernstige longontsteking veroorzaakt door COVID-19 te behandelen en hebben veelbelovende resultaten opgeleverd. Onlangs hebben genetisch gemanipuleerde EV’s met CD24-eiwitten ook krachtige therapeutische voordelen aangetoond voor de behandeling van COVID-19-patiënten15,16. Aan de klinische eis van EV-therapie kan echter nog steeds niet worden voldaan met traditionele isolatiemethoden vanwege de lage opbrengst en kosten. Deze studie rapporteert de grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels via een magnetische scheiding-geassisteerde high-speed homogenisatiebenadering. Het maakt gebruik van de endocytoseroute van MNP’s om MNP-geladen endosomen te isoleren via magnetische scheiding, gevolgd door homogenisatie met hoge snelheid om endosomen te formuleren in monodisperse nanovesikels. Aangezien de soorten endosomen die door dit protocol worden verzameld divers zijn, is verder diepgaand onderzoek nog steeds nodig om goede productiepraktijken (GMP) in de industrie vast te stellen. Deze nieuwe EM-voorbereidingsaanpak is tijdbesparender (5 minuten homogenisatie op hoge snelheid) om nanoblaasjes te verkrijgen die homoloog zijn aan native EV’s. Het produceert exponentieel meer blaasjes uit dezelfde hoeveelheden cellen dan ultracentrifugatie, die over het algemeen op verschillende celtypen kan worden toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als surrogaat van celvrije therapie en een medicijnafgiftesysteem op nanoschaal moeten EV’s nog aan hun klinische verwachtingen voldoen, en een belangrijk obstakel is het gebrek aan schaalbare en reproduceerbare productie- en zuiveringsmethoden6. Daarom zijn er verschillende soorten EM’s ontwikkeld als EV-analogen met een vergelijkbare biologische complexiteit14. Tot op heden is het meest gebruikte EM-voorbeeld celplasmamembraan-afgeleide nanovesikels. De bereiding van derg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen het gebruik van instrumenten in de Shared Instrumentation Core Facility van het Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academie van Wetenschappen. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang, China (LZ22H310001), het 551 Health Talent Training Project van de Health Commission van de provincie Zhejiang, China, het Agricultural and Social Development Research Project van het Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) en Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
