Procédé d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de vésicules dérivées d’endosomes
Summary
Ici, nous décrivons une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) qui partagent la même origine biologique et une structure, une morphologie et une composition protéique similaires aux vésicules extracellulaires (VE) natives.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) ont attiré une attention considérable dans la recherche physiologique et pathologique, le diagnostic des maladies et le traitement ; Cependant, leur application clinique a été limitée par l’absence d’approches de fabrication à grande échelle. Par conséquent, ce protocole fournit une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) dérivés des endosomes, qui ont un rendement environ 100 fois supérieur à celui de la méthode d’ultracentrifugation conventionnelle. Dans cette méthode, les nanoparticules magnétiques (MNP) ont été internalisées par les cellules parentales via endocytose et ont ensuite été accumulées dans leurs endosomes. Ensuite, les endosomes chargés de MNP ont été collectés et purifiés par traitement hypotonique et séparation magnétique. Un homogénéisateur à grande vitesse a été utilisé pour décomposer les endosomes chargés de MNP en nanovésicules monodisperses. Les vésicules dérivées des endosomes qui en résultent présentent la même origine biologique et la même structure, caractérisées par l’analyse de suivi des nanoparticules, le microscope électronique à transmission et le western blot. Leur morphologie et leur composition protéique sont similaires à celles des VE natifs, ce qui indique que les ME peuvent potentiellement servir de substitut à faible coût et à haut rendement des VE natifs pour les traductions cliniques.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules sécrétées par presque toutes les cellules d’une taille comprise entre 30 et 150 nm, contenant des substances bioactives abondantes. Selon la cellule d’origine, les VE présentent une grande hétérogénéité, possédant de multiples composants spécifiques aux cellules mères1. Les VE sont libérés dans les fluides corporels et transportés vers des sites éloignés où ils sont absorbés par les cellules cibles pour l’action2, qui peut être utilisée pour délivrer une large gamme de molécules et de médicaments bioactifs pour la réparation des tissus, le diagnostic et le traitement des tumeurs et la modulation immunitaire 3,4. Cependant, d’autres nanoparticules biologiques (p. ex., les lipoprotéines) et nanovésicules (p. ex., les VE dérivées de voies non endosomales) ayant des propriétés biophysiques similaires dans les fluides corporels affectent inévitablement l’isolement et la purification des VE. À ce jour, l’ultracentrifugation reste l’étalon-or pour l’isolation des véhicules électriques, et d’autres méthodes d’isolement, notamment la centrifugation à gradient de densité du saccharose, l’ultrafiltration, la précipitation du polyéthylène glycol, la chromatographie et l’isolement des billes immunomagnétiques, ont été développées5. Le goulot d’étranglement actuel qui limite la traduction clinique et la commercialisation des produits thérapeutiques contre les VE est le manque cruel de techniques d’isolement qui permettent un isolement hautement évolutif et reproductible des VE 6,7,8. Les techniques traditionnelles d’isolement des VE (par exemple, l’ultracentrifugation et la chromatographie d’exclusion de taille) souffrent d’un faible rendement (1 x 107-1 x 108/1 x 106 cellules), d’un cycle de production long (24-48 h), d’une mauvaise reproductibilité de la qualité du produit et nécessitent des équipements de production coûteux et énergivores qui ne peuvent pas répondre à la demande clinique actuelle de VE6.
Les imitateurs d’exosomes (EM), substituts synthétiques des VE natifs, ont attiré une attention importante en raison de leur structure, de leur fonction et de leur évolutivité très similaires en production. La principale source d’EM provient de l’extrusion directe de cellules parentales entières avec une section continue 9,10, démontrant des fonctions biologiques puissantes en tant que VE natives11,12. Par exemple, les EM dérivées de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hUCMSCs) exercent des effets de cicatrisation similaires à ceux des VE natives et sont plus riches en protéines13. Bien que les EM dérivés de cellules entières aient la complexité biologique des VE, leur principal inconvénient est l’hétérogénéité des produits car ils sont inévitablement contaminés par divers organites cellulaires et débris cellulaires. L’analyse de la localisation des protéines a en outre révélé que les EM dérivés de l’extrusion de cellules entières contiennent de nombreuses protéines non spécifiques aux VE provenant des mitochondries et du réticulum endoplasmique13. De plus, la plupart des méthodes de fabrication des EM nécessitent encore une ultracentrifugation, un processus très long et énergivore14. Compte tenu du fait que les exosomes sont exclusivement dérivés d’endosomes cellulaires, nous avons émis l’hypothèse que les nanovésicules dérivées d’endosomes issues de la bio-ingénierie pourraient mieux récapituler l’homologie biologique entre les exosomes et les EM par rapport aux EM bien établies dérivées de la membrane cellulaire produites par la méthode d’extrusion de cellules entières14. Néanmoins, la fabrication de nanovésicules dérivées de l’endosome est difficile en raison du manque d’approches viables.
Des études cliniques ont été menées en utilisant les VE comme substitut d’une thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique pour le traitement de diverses maladies. Par exemple, les VE dérivés de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont été utilisés pour traiter la pneumonie sévère causée par la COVID-19 et ont obtenu des résultats prometteurs. Récemment, des VE génétiquement modifiés porteurs de protéines CD24 ont également démontré de puissants avantages thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de COVID-1915,16. Cependant, l’exigence clinique de la thérapie EV ne peut toujours pas être satisfaite avec les méthodes d’isolement traditionnelles en raison du faible rendement et du faible coût. Cette étude rend compte de la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes via une approche d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique. Il tire parti de la voie d’endocytose des MNP pour isoler les endosomes chargés de MNP par séparation magnétique, suivie d’une homogénéisation à grande vitesse pour formuler les endosomes en nanovésicules monodisperses. Étant donné que les types d’endosomes collectés par ce protocole sont divers, des recherches plus approfondies sont encore nécessaires pour établir de bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans l’industrie. Cette nouvelle approche de préparation EM est plus efficace en termes de temps (5 min d’homogénéisation à grande vitesse) pour obtenir des nanovésicules homologues aux VE natives. Elle produit exponentiellement plus de vésicules à partir des mêmes quantités de cellules que l’ultracentrifugation, qui peut généralement être appliquée à différents types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
En tant que substitut de la thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique, les VE n’ont pas encore répondu à leurs attentes cliniques, et l’un des principaux obstacles est le manque de méthodes de production et de purification évolutives et reproductibles6. Par conséquent, divers types d’EM ont été développés en tant qu’analogues de VE avec une complexité biologique similaire14. À ce jour, l’ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’utilisation d’instruments à l’installation centrale d’instrumentation partagée de l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie (IBMC) de l’Académie chinoise des sciences. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC ; 82172598), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang, en Chine (LZ22H310001), le projet de formation des talents en santé 551 de la Commission de la santé de la province du Zhejiang, en Chine, le projet de recherche sur le développement agricole et social du Bureau municipal des sciences et de la technologie de Hangzhou (2022ZDSJ0474) et la subvention de recherche interdisciplinaire de Qiantang.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
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