Un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica per la produzione su larga scala di vescicole derivate da endosomi
Summary
Qui, descriviamo un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistita da separazione magnetica per la produzione su larga scala di nanovescicole derivate dall’endosoma come un nuovo tipo di mimici degli esosomi (EM) che condividono la stessa origine biologica e struttura, morfologia e composizione proteica simili delle vescicole extracellulari (EV) native.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) hanno attirato un’attenzione significativa nella ricerca fisiologica e patologica, nella diagnosi e nel trattamento delle malattie; Tuttavia, la loro traduzione clinica è stata limitata dalla mancanza di approcci di produzione su larga scala. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica per la produzione su larga scala di nanovescicole derivate da endosomi come un nuovo tipo di mimici degli esosomi (EM) derivati dagli endosomi, che hanno una resa circa 100 volte superiore rispetto al metodo di ultracentrifugazione convenzionale. In questo metodo, le nanoparticelle magnetiche (MNP) sono state internalizzate dalle cellule parentali tramite endocitosi e sono state successivamente accumulate all’interno dei loro endosomi. Quindi, gli endosomi caricati con MNPs sono stati raccolti e purificati mediante trattamento ipotonico e separazione magnetica. Un omogeneizzatore ad alta velocità è stato utilizzato per rompere gli endosomi caricati con MNP in nanovescicole monodisperse. Le vescicole derivate dall’endosoma risultanti presentano la stessa origine biologica e struttura, caratterizzate dall’analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal microscopio elettronico a trasmissione e dal western blotting. La loro morfologia e composizione proteica sono simili a quelle delle vescicole extracellulari native, il che indica che le vescicole extracellulari possono potenzialmente fungere da surrogato a basso costo e ad alto rendimento delle vescicole extracellulari native per le traduzioni cliniche.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole secrete da quasi tutte le cellule con una gamma di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm, contenenti abbondanti sostanze bioattive. A seconda della cellula di origine, le vescicole extracellulari mostrano un’elevata eterogeneità, possedendo più componenti specifiche per le cellule madri1. Le vescicole extracellulari vengono rilasciate nei fluidi corporei e trasportate in siti distanti dove vengono assorbite dalle cellule bersaglio per l’azione2, che può essere utilizzata per fornire un’ampia gamma di molecole bioattive e farmaci per la riparazione dei tessuti, la diagnosi e il trattamento dei tumori e la modulazione immunitaria 3,4. Tuttavia, altre nanoparticelle biologiche (ad esempio, lipoproteine) e nanovescicole (ad esempio, vescicole extracellulari derivate da percorsi non endosomiali) con proprietà biofisiche simili nei fluidi corporei influenzano inevitabilmente l’isolamento e la purificazione delle vescicole extracellulari. Ad oggi, l’ultracentrifugazione rimane il gold standard per l’isolamento delle EV e sono stati sviluppati altri metodi di isolamento, tra cui la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio, l’ultrafiltrazione, la precipitazione del polietilenglicole, la cromatografia e l’isolamento delle microsfere immunomagnetiche5. L’attuale collo di bottiglia che limita la traduzione clinica e la commercializzazione delle terapie con EV è la grave mancanza di tecniche di isolamento che consentano un isolamento altamente scalabile e riproducibile delle EV 6,7,8. Le tecniche tradizionali di isolamento delle vescicole extracellulari (ad esempio, l’ultracentrifugazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale) soffrono di una bassa resa (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 cellule), di un lungo ciclo di produzione (24-48 ore), di una scarsa riproducibilità della qualità del prodotto e richiedono apparecchiature di produzione costose e ad alta intensità energetica che non sono in grado di soddisfare l’attuale domanda clinica di vescicole extracellulari6.
I mimici degli esosomi (EM), surrogati sintetici delle vescicole extracellulari native, hanno attirato un’attenzione importante a causa della loro struttura, funzione e scalabilità molto simili nella produzione. La principale fonte di EM proviene dall’estrusione diretta di intere cellule parentali con sezionamento continuo 9,10, dimostrando potenti funzioni biologiche come EV native11,12. Ad esempio, gli EM derivati dalle cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (hUCMSC) esercitano effetti di guarigione delle ferite simili a quelli delle vescicole extracellulari native e sono più ricchi di composizione proteica13. Sebbene gli EM derivati da cellule intere abbiano la complessità biologica delle vescicole extracellulari, il loro principale svantaggio è l’eterogeneità dei prodotti perché sono inevitabilmente contaminati da vari organelli cellulari e detriti cellulari. L’analisi della localizzazione delle proteine ha inoltre rivelato che gli EM derivati dall’estrusione di cellule intere contengono molte proteine non specifiche per le vescicole extracellulari provenienti dai mitocondri e dal reticolo endoplasmatico13. Inoltre, la maggior parte dei metodi per la produzione di EM richiede ancora l’ultracentrifugazione, un processo che richiede molto tempo ed energia14. Considerando il fatto che gli esosomi derivano esclusivamente da endosomi cellulari, abbiamo ipotizzato che le nanovescicole derivate da endosomi bioingegnerizzati possano ricapitolare meglio l’omologia biologica tra esosomi ed EM rispetto agli EM derivati dalla membrana cellulare ben consolidati prodotti con il metodo di estrusione dell’intera cellula14. Tuttavia, la produzione di nanovescicole derivate da endosomi è difficile a causa della mancanza di approcci praticabili.
Sono stati condotti studi clinici utilizzando le vescicole extracellulari come surrogato della terapia cell-free e di un sistema di somministrazione di farmaci su scala nanometrica per il trattamento di varie malattie. Ad esempio, le vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo sono state utilizzate per trattare la polmonite grave causata da COVID-19 e hanno ottenuto risultati promettenti. Recentemente, anche le vescicole extracellulari geneticamente modificate che trasportano le proteine CD24 hanno dimostrato potenti benefici terapeutici per il trattamento dei pazienti COVID-1915,16. Tuttavia, il requisito clinico della terapia con EV non può ancora essere soddisfatto con i metodi di isolamento tradizionali a causa della bassa resa e del basso costo. Questo studio riporta la produzione su larga scala di nanovescicole derivate dall’endosoma attraverso un approccio di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica. Sfrutta la via dell’endocitosi delle MNP per isolare gli endosomi caricati con MNP tramite separazione magnetica, seguita da omogeneizzazione ad alta velocità per formulare gli endosomi in nanovescicole monodisperse. Poiché i tipi di endosomi raccolti da questo protocollo sono diversi, sono ancora necessarie ulteriori ricerche approfondite per stabilire le buone pratiche di fabbricazione (GMP) nel settore. Questo nuovo approccio di preparazione EM è più efficiente in termini di tempo (5 minuti di omogeneizzazione ad alta velocità) per ottenere nanovescicole omologhe alle vescicole extracellulari native. Produce esponenzialmente più vescicole dalla stessa quantità di cellule rispetto all’ultracentrifugazione, che può essere generalmente applicata a vari tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come surrogato della terapia cell-free e di un sistema di somministrazione di farmaci su scala nanometrica, le vescicole extracellulari devono ancora soddisfare le loro aspettative cliniche e un ostacolo principale è la mancanza di metodi di produzione e purificazione scalabili e riproducibili6. Pertanto, vari tipi di EM sono stati sviluppati come analoghi delle EV con complessità biologica simile14. Ad oggi, l’esempio EM più comunemente usato sono le nanovescicole deriv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono l’uso di strumenti presso la Shared Instrumentation Core Facility presso l’Istituto di Medicina di Base e Cancro (IBMC), Accademia Cinese delle Scienze. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang, Cina (LZ22H310001), dal 551 Health Talent Training Project della Health Commission of Zhejiang Province, Cina, dal Progetto di ricerca sullo sviluppo agricolo e sociale dell’Ufficio municipale per la scienza e la tecnologia di Hangzhou (2022ZDSJ0474) e dalla sovvenzione di ricerca interdisciplinare Qiantang.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
