エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法
Summary
本稿では、天然の細胞外小胞(EV)の生物学的起源と構造、形態、タンパク質組成が類似する新しいタイプのエクソソーム模倣体(EM)として、エンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産のための磁気分離支援高速ホモジナイズ法について述べる。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、生理学的および病理学的研究、疾患の診断、および治療において大きな注目を集めています。しかし、スケールアップ製造アプローチの欠如により、その臨床的翻訳は制限されてきました。そこで、本プロトコルは、従来の超遠心分離法の約100倍の収率を有するエンドソーム由来のナノベシクルを、エンドソーム由来のエキソソーム模倣体(EM)として大量生産するための磁気分離支援高速均質化法を提供する。この方法では、磁性ナノ粒子(MNP)がエンドサイトーシスを介して親細胞によって取り込まれ、その後エンドソーム内に蓄積されました。その後、MNPを充填したエンドソームを回収し、低張処理と磁気分離により精製した。高速ホモジナイザーを使用して、MNPをロードしたエンドソームを単分散ナノベシクルに分解しました。得られたエンドソーム由来の小胞は、ナノ粒子追跡分析、透過型電子顕微鏡、およびウェスタンブロッティングを特徴とする、同じ生物学的起源と構造を特徴としています。その形態とタンパク質組成は天然EVと類似しており、EMは臨床翻訳のためのネイティブEVの低コストで高収率の代替物として機能する可能性があることを示しています。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、30〜150 nmのサイズ範囲でほぼすべての細胞から分泌される小さな小胞であり、豊富な生理活性物質を含んでいます。EVは、起源の細胞にもよりますが、高い不均一性を示し、親細胞に特異的な複数の成分を持っています1。EVは体液中に放出され、遠隔地に運ばれ、そこで標的細胞に取り込まれて作用し2、組織の修復、腫瘍の診断と治療、免疫調節のための幅広い生理活性分子や薬剤の送達に利用することができる3,4。しかし、体液中で同様の生物物理学的特性を持つ他の生物学的ナノ粒子(リポタンパク質など)やナノベシクル(非エンドソーム経路由来のEV)は、EVの単離と精製に必然的に影響を及ぼします。現在まで、超遠心分離は依然としてEV単離のゴールドスタンダードであり、スクロース密度勾配遠心分離、限外ろ過、ポリエチレングリコール沈殿、クロマトグラフィー、免疫磁気ビーズ単離などの他の分離法が開発されています5。EV治療薬の臨床翻訳と商業化を制限する現在のボトルネックは、EVの高度にスケーラブルで再現性の高い分離を可能にする分離技術の深刻な欠如です6、7、8。従来のEV単離技術(超遠心分離やサイズ排除クロマトグラフィーなど)は、収率が低い(1 x 107-1 x10 8/1 x 106細胞)、長い生産サイクル(24-48時間)、製品品質の再現性が低く、高価でエネルギー集約的な生産設備を必要とするため、EVに対する現在の臨床需要を満たすことができません6。
在来EVの合成代替品であるエクソソーム模倣体(EM)は、構造、機能、生産のスケーラビリティが非常に似ているため、重要な注目を集めています。EMの主な発生源は、連続切片化による親細胞全体の直接押し出しによるもので9,10、天然EVとしての強力な生物学的機能を示しています11,12。例えば、ヒト臍帯間葉系幹細胞(hUCMSC)に由来するEMは、天然のEVと同様の創傷治癒効果を発揮し、タンパク質組成が豊富である13。全細胞由来のEMはEVのような生物学的な複雑さを持っていますが、その主な欠点は、さまざまな細胞小器官や細胞破片によって必然的に汚染されるため、製品の不均一性です。さらに、タンパク質局在解析により、全細胞押出に由来するEMには、ミトコンドリアや小胞体由来の非EV特異的タンパク質が多数含まれていることが明らかになった13。さらに、EMを製造するためのほとんどの方法は、非常に時間とエネルギーを消費するプロセスである超遠心分離を必要とします14。エクソソームが細胞エンドソームのみに由来するという事実を考慮し、バイオエンジニアリングされたエンドソーム由来のナノベシクルは、全細胞押出法によって生成された確立された細胞膜由来のEMと比較して、エクソソームとEMの間の生物学的相同性をよりよく再現する可能性があるという仮説を立てました14。それにもかかわらず、エンドソーム由来のナノベシクルの製造は、実行可能なアプローチがないために困難です。
EVを無細胞治療の代替として、またナノスケールのドラッグデリバリーシステムとして、様々な疾患の治療に活用した臨床研究が行われています。例えば、骨髄間葉系幹細胞由来のEVは、COVID-19による重症肺炎の治療に使用され、有望な結果を達成しています。最近では、CD24タンパク質を搭載した遺伝子組み換えEVも、COVID-19患者の治療に強力な治療効果があることが実証されています15,16。しかし、EV療法の臨床的要件は、収量とコストが低いため、従来の分離方法ではまだ満たすことができません。本研究は、磁気分離支援高速均質化法によるエンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産について報告する。MNPのエンドサイトーシス経路を利用して、MNPがロードされたエンドソームを磁気分離によって分離し、その後、高速ホモジナイズしてエンドソームを単分散ナノベシクルに製剤化します。このプロトコルによって収集されるエンドソームの種類は多様であるため、業界で適正製造基準(GMP)を確立するには、さらに詳細な研究が必要です。この新しいEM調製アプローチは、ネイティブEVと相同なナノベシクルを得るための時間効率(5分間の高速ホモジナイズ)です。これは、一般的にさまざまな細胞タイプに適用できる超遠心分離よりも、同じ量の細胞から指数関数的に多くの小胞を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
無細胞治療とナノスケールのドラッグデリバリーシステムの代替物であるEVは、臨床上の期待にまだ応えられておらず、主な障害は、スケーラブルで再現性のある製造および精製方法の欠如です6。そのため、生物学的に複雑な性質を持つEV類似体として、様々な種類のEMが開発されている14。現在、最も一般的に使用されているEMの例は、細胞質膜由来のナ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、中国科学院基礎医学・がん研究所(IBMC)の共用機器コア施設で機器が使用されていることを認めている。本研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC;82172598)、中国浙江省自然科学基金会(LZ22H310001)、中国浙江省衛生健康委員会の551健康人材育成プロジェクト、杭州市科学技術局農業社会発展研究プロジェクト(2022ZDSJ0474)、銭塘学際研究助成金の支援を受けた。
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
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