엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법
Summary
여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.
Abstract
세포외 소포체(EV)는 생리학 및 병리학적 연구, 질병 진단 및 치료에 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 그들의 임상 번역은 스케일업 제조 접근 방식의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서, 본 프로토콜은 엔도솜 유래 엑소좀 모방체(EM)의 새로운 유형으로서 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 제공하며, 이는 기존의 초원심분리 방식보다 약 100배 높은 수율을 가지고 있습니다. 이 방법에서 자성 나노 입자(MMP)는 세포내이입(endocytosis)을 통해 부모 세포에 의해 내재화되고 이후 엔도솜 내에 축적되었습니다. 그런 다음, MNP가 로드된 엔도솜을 수집하고 저긴장 처리 및 자기 분리를 통해 정제했습니다. 고속 균질화기는 MNP가 로드된 엔도솜을 단분산 나노소포로 분해하는 데 사용되었습니다. 그 결과 엔도솜 유래 소포는 동일한 생물학적 기원과 구조를 특징으로 하며, 나노 입자 추적 분석, 투과 전자 현미경 및 웨스턴 블로팅을 특징으로 합니다. EM의 형태 및 단백질 조성은 네이티브 EV와 유사하며, 이는 EM이 임상 번역을 위한 네이티브 EV의 저비용 및 고수율 대용품 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
Introduction
세포외 소포체(EV)는 30-150nm의 크기 범위를 가진 거의 모든 세포에서 분비되는 작은 소포로, 풍부한 생리 활성 물질을 함유하고 있습니다. 기원 세포에 따라 EV는 높은 이질성을 보이며, 모세포에 특이적인 여러 구성 요소를 가지고있습니다 1. EV는 체액으로 방출되어 먼 부위로 운반되어 조직 복구, 종양 진단 및 치료, 면역 조절을 위한 광범위한 생체 활성 분자 및 약물을 전달하는 데 활용될 수 있는 작용2을 위해 표적 세포에 의해 흡수됩니다 3,4. 그러나 체액에서 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 다른 생물학적 나노입자(예: 지단백질) 및 나노소포(예: 비엔도솜 경로에서 파생된 EV)는 필연적으로 EV 분리 및 정제에 영향을 미칩니다. 현재까지 초원심분리는 EV 분리의 황금 표준으로 남아 있으며, 자당 밀도 구배 원심분리, 한외여과, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 크로마토그래피 및 면역자성 비드 분리를 포함한 기타 분리 방법이 개발되었습니다5. EV 치료제의 임상 번역 및 상용화를 제한하는 현재 병목 현상은 EV의 확장성과 재현성이 높은 분리를 허용하는 분리 기술의 심각한 부족입니다 6,7,8. 기존의 EV 분리 기술(예: 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피)은 낮은 수율(1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 세포), 긴 생산 주기(24-48시간), 제품 품질의 낮은 재현성, EV에 대한 현재 임상 수요를 충족할 수 없는 고가의 에너지 집약적인 생산 장비가 필요합니다6.
네이티브 EV의 합성 대리물인 엑소좀 모방체(EM)는 매우 유사한 구조, 기능 및 생산 확장성으로 인해 중요한 주목을 받고 있습니다. EM의 주요 공급원은 연속 절편(continuous sectioning)9,10을 가진 전체 부모 세포의 직접 압출에 의한 것으로, 네이티브 EV(native EV)11,12로서 강력한 생물학적 기능을 보여준다. 예를 들어, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(hUCMSCs)에서 유래한 EM은 네이티브 EV와 유사한 상처 치유 효과를 발휘하며 단백질 구성이 더 풍부하다13. 전체 세포에서 파생된 EM은 EV의 생물학적 복잡성을 가지고 있지만 주요 단점은 다양한 세포 소기관과 세포 파편에 의해 필연적으로 오염되기 때문에 제품의 이질성입니다. 단백질 국소화 분석은 또한 전체 세포 압출에서 유래한 EM이 미토콘드리아와 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 많은 비EV 특이적 단백질을 포함한다는 것을 밝혀냈다13. 더욱이, EM을 제조하는 대부분의 방법은 여전히 시간과 에너지가 많이 소요되는 공정인 초원심분리를 필요로 한다14. 엑소좀이 세포 엔도솜에서만 유래한다는 사실을 고려하여, 우리는 생체공학적 엔도솜 유래 나노소포가 전체 세포 압출 방법으로 생성된 잘 확립된 세포막 유래 EM과 비교하여 엑소좀과 EM 간의 생물학적 상동성을 더 잘 재현할 수 있다는 가설을 세웠습니다 14. 그럼에도 불구하고 엔도솜 유래 나노 소포의 제조는 실행 가능한 접근 방식이 없기 때문에 어렵습니다.
다양한 질병 치료를 위한 무세포 치료제와 나노 단위의 약물 전달 시스템의 대용물로 EV를 활용하여 임상 연구가 수행되었습니다. 예를 들어, 골수 중간엽 줄기세포에서 유래한 EV는 COVID-19로 인한 중증 폐렴 치료에 사용되어 유망한 결과를 얻었습니다. 최근에는 CD24 단백질을 운반하는 유전자 조작 EV도 COVID-19 환자 치료에 강력한 치료 효과를 입증했습니다15,16. 그러나 EV 요법의 임상적 요구 사항은 낮은 수율과 비용 때문에 전통적인 분리 방법으로는 여전히 충족할 수 없습니다. 이 연구는 자기 분리 보조 고속 균질화 접근 방식을 통한 엔도솜 유래 나노 소포의 대규모 생산을 보고합니다. MNP의 세포내이입 경로를 이용하여 자기 분리를 통해 MNP가 로드된 엔도솜을 분리한 다음 고속 균질화를 통해 엔도솜을 단분산 나노소포로 제형화합니다. 이 프로토콜에 의해 수집되는 엔도솜의 유형은 다양하기 때문에 업계에서 우수제조관리기준(GMP)을 확립하기 위해서는 여전히 심층적인 연구가 필요합니다. 이 새로운 EM 준비 접근 방식은 더 시간 효율적(고속 균질화 5분)하여 네이티브 EV와 상동적인 나노 소포를 얻을 수 있습니다. 초원심분리보다 동일한 양의 세포에서 기하급수적으로 더 많은 소포를 생성하며, 이는 일반적으로 다양한 세포 유형에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
무세포 치료제 및 나노 단위 약물 전달 시스템의 대체물인 EV는 아직 임상적 기대치를 충족하지 못했으며, 주요 장애물은 확장 가능하고 재현 가능한 생산 및 정제 방법이 부족하다는 것입니다6. 따라서 다양한 유형의 EM이 유사한 생물학적 복잡성을 가진 EV 유사체로 개발되었습니다14. 현재까지 가장 일반적으로 사용되는 EM의 예는 세포 원형질막 유래 나노소포…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 중국과학원(Chinese Academy of Sciences) 기초 의학 및 암 연구소(Institute of Basic Medicine and Cancer, IBMC)의 공유 계측 핵심 시설(Shared Instrumentation Core Facility)에서 기기를 사용하는 것을 인정합니다. 이 연구는 중국국가자연과학재단(NSFC; 82172598), 중국 저장성 자연과학재단(LZ22H310001), 중국 저장성 건강위원회 551 건강인재 양성 프로젝트, 항저우시 과학기술국 농업 및 사회 발전 연구 프로젝트(2022ZDSJ0474) 및 첸탕 학제간 연구 보조금의 지원을 받았다.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
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