En magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode for storskala produksjon av endosomavledede vesikler
Summary
Her beskriver vi en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode for storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler som en ny type eksosometterligninger (EM) som deler samme biologiske opprinnelse og lignende struktur, morfologi og proteinsammensetning av innfødte ekstracellulære vesikler (EV).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) har tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet i fysiologisk og patologisk forskning, sykdomsdiagnose og behandling; Imidlertid har deres kliniske oversettelse blitt begrenset av mangelen på oppskaleringsproduksjonsmetoder. Derfor gir denne protokollen en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode for storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler som en ny type eksosometterligninger (EM) avledet fra endosomene, som har omtrent 100 ganger høyere utbytte enn konvensjonell ultrasentrifugeringsmetode. I denne metoden ble magnetiske nanopartikler (MNP) internalisert av foreldreceller via endocytose og ble deretter akkumulert i deres endosomer. Deretter ble MNP-belastede endosomer samlet og renset ved hypotonisk behandling og magnetisk separasjon. En høyhastighets homogenisator ble benyttet til å bryte MNP-belastede endosomer i monodisperse nanovesikler. De resulterende endosomavledede vesiklene har samme biologiske opprinnelse og struktur, karakterisert ved nanopartikkelsporingsanalyse, transmisjonselektronmikroskop og vestlig blotting. Deres morfologi og proteinsammensetning ligner på innfødte EV-er, noe som indikerer at EM-er potensielt kan tjene som et billig surrogat med høy avkastning av innfødte elbiler for kliniske oversettelser.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV) er små vesikler som utskilles av nesten alle celler med et størrelsesområde på 30-150 nm, som inneholder rikelig med bioaktive stoffer. Avhengig av opprinnelsescellen viser EV høy heterogenitet, og har flere komponenter som er spesifikke for foreldreceller1. EV-er slippes ut i kroppsvæsker og transporteres til fjerne steder hvor de tas opp av målceller for handling2, som kan brukes til å levere et bredt spekter av bioaktive molekyler og medisiner for vevsreparasjon, tumordiagnose og behandling og immunmodulering 3,4. Imidlertid påvirker andre biologiske nanopartikler (f.eks. Lipoproteiner) og nanovesikler (f.eks. EV avledet fra ikke-endosomale veier) med lignende biofysiske egenskaper i kroppsvæsker uunngåelig EV-isolasjon og rensing. Til dags dato er ultrasentrifugering fortsatt gullstandarden for EV-isolasjon, og andre isolasjonsmetoder, inkludert sentrifugering av sukrosetetthetsgradient, ultrafiltrering, polyetylenglykolutfelling, kromatografi og immunmagnetisk perleisolasjon, har blitt utviklet5. Den nåværende flaskehalsen som begrenser klinisk oversettelse og kommersialisering av EV-terapi er den alvorlige mangelen på isolasjonsteknikker som muliggjør svært skalerbar og reproduserbar isolasjon av EV 6,7,8. Tradisjonelle EV-isolasjonsteknikker (f.eks. ultrasentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi) lider av lavt utbytte (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 celler), lang produksjonssyklus (24-48 timer), dårlig reproduserbarhet av produktkvalitet, og krever dyrt og energiintensivt produksjonsutstyr som ikke kan møte dagens kliniske etterspørsel etter EV6.
Exosome mimics (EMs), syntetiske surrogater av innfødte EVer, har tiltrukket seg viktig oppmerksomhet på grunn av deres svært like struktur, funksjon og skalerbarhet i produksjonen. Hovedkilden til EM er fra direkte ekstrudering av hele foreldreceller med kontinuerlig seksjonering9,10, som demonstrerer potente biologiske funksjoner som innfødte EV11,12. For eksempel utøver EM avledet fra humane navlestrengsmesenkymale stamceller (hUCMSC) lignende sårhelende effekter som innfødte EV og er rikere på proteinsammensetning13. Selv om EM avledet fra hele celler har den biologiske kompleksiteten til EV, er deres største ulempe heterogeniteten til produkter fordi de uunngåelig er forurenset av forskjellige cellulære organeller og celleavfall. Proteinlokaliseringsanalyse viste videre at EM avledet fra helcelleekstrudering inneholder mange ikke-EV-spesifikke proteiner fra mitokondrier og endoplasmatisk retikulum13. Videre krever de fleste metoder for produksjon av EM fortsatt ultrasentrifugering, en svært tid- og energikrevende prosess14. Tatt i betraktning det faktum at eksosomer utelukkende er avledet fra cellulære endosomer, antydet vi at bioengineerte endosomavledede nanovesikler bedre kan rekapitulere den biologiske homologien mellom eksosomer og EM i sammenligning med de veletablerte cellemembranavledede EMene produsert ved helcelleekstruderingsmetode14. Likevel er fremstillingen av endosomavledede nanovesikler vanskelig på grunn av mangel på levedyktige tilnærminger.
Kliniske studier har blitt utført ved å bruke EV som surrogat for cellefri terapi og et nanoskala legemiddelleveringssystem for behandling av ulike sykdommer. For eksempel har EV avledet fra benmarg mesenkymale stamceller blitt brukt til å behandle alvorlig lungebetennelse forårsaket av COVID-19 og har oppnådd lovende resultater. Nylig har genetisk konstruerte elbiler som bærer CD24-proteiner også vist potente terapeutiske fordeler for behandling av COVID-19-pasienter15,16. Imidlertid kan det kliniske kravet til EV-terapi fortsatt ikke oppfylles med tradisjonelle isolasjonsmetoder på grunn av lavt utbytte og kostnad. Denne studien rapporterer storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler via en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode. Det utnytter endocytoseveien til MNPs for å isolere MNP-belastede endosomer via magnetisk separasjon, etterfulgt av høyhastighets homogenisering for å formulere endosomer i monodisperse nanovesikler. Siden typer endosomer samlet inn av denne protokollen er forskjellige, er det fortsatt nødvendig med ytterligere grundig forskning for å etablere god produksjonspraksis (GMP) i bransjen. Denne nye EM-forberedelsesmetoden er mer tidseffektiv (5 min høyhastighets homogenisering) for å oppnå nanovesikler som er homologe med innfødte EVer. Det produserer eksponentielt flere vesikler fra samme mengder celler enn ultracentrifugation, som generelt kan brukes på forskjellige celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som et surrogat for cellefri terapi og et nanoskala legemiddelleveringssystem har elbiler ennå ikke oppfylt sine kliniske forventninger, og en hovedhindring er mangelen på skalerbare og reproduserbare produksjons- og rensemetoder6. Derfor har ulike typer EM blitt utviklet som EV-analoger med tilsvarende biologisk kompleksitet14. Til dags dato er det mest brukte EM-eksemplet celleplasmamembranavledede nanovesikler. Fremstillingen av slike nanovesikler er relativt enkel og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner bruken av instrumenter ved Shared Instrumentation Core Facility ved Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang-provinsen, Kina, Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) og Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
