Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo
Summary
Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) têm atraído atenção significativa em pesquisas fisiológicas e patológicas, diagnóstico e tratamento de doenças; no entanto, sua tradução clínica tem sido limitada pela falta de abordagens de fabricação em escala. Portanto, este protocolo fornece um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) derivados dos endossomos, que têm rendimento cerca de 100 vezes maior do que o método convencional de ultracentrifugação. Neste método, nanopartículas magnéticas (MNPs) foram internalizadas pelas células parentais via endocitose e foram posteriormente acumuladas dentro de seus endossomos. Em seguida, endossomos carregados com MNPs foram coletados e purificados por tratamento hipotônico e separação magnética. Um homogeneizador de alta velocidade foi utilizado para quebrar endossomos carregados com MNP em nanovesículas monodispersas. As vesículas derivadas do endossomo resultantes apresentam a mesma origem biológica e estrutura, caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas, microscópio eletrônico de transmissão e western blotting. Sua morfologia e composição proteica são semelhantes às EVs nativas, indicando que as MEs podem potencialmente servir como substitutas de baixo custo e alto rendimento de EVs nativas para traduções clínicas.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são pequenas vesículas secretadas por quase todas as células com uma faixa de tamanho de 30-150 nm, contendo substâncias bioativas abundantes. Dependendo da célula de origem, os EVs apresentam alta heterogeneidade, possuindo múltiplos componentes específicos das células-mãe1. Os EVs são liberados em fluidos corporais e transportados para locais distantes, onde são absorvidos pelas células-alvo para a ação2, que podem ser utilizados para fornecer uma ampla gama de moléculas bioativas e fármacos para reparo tecidual, diagnóstico e tratamento tumoral e modulação imunológica 3,4. No entanto, outras nanopartículas biológicas (por exemplo, lipoproteínas) e nanovesículas (por exemplo, EVs derivados de vias não endossomais) com propriedades biofísicas semelhantes em fluidos corporais inevitavelmente afetam o isolamento e a purificação de EV. Até o momento, a ultracentrifugação continua sendo o padrão ouro para o isolamento de EV, e outros métodos de isolamento, incluindo centrifugação por gradiente de densidade de sacarose, ultrafiltração, precipitação de polietilenoglicol, cromatografia e isolamento de esferas imunomagnéticas, foram desenvolvidos5. O gargalo atual que limita a tradução clínica e a comercialização da terapêutica de EV é a grave falta de técnicas de isolamento que permitam o isolamento altamente escalável e reprodutível dos EVs 6,7,8. As técnicas tradicionais de isolamento de EV (por exemplo, ultracentrifugação e cromatografia de exclusão de tamanho) sofrem de baixo rendimento (1 x 107-1 x 108/1 x 106 células), longo ciclo de produção (24-48 h), baixa reprodutibilidade da qualidade do produto e requerem equipamentos de produção caros e intensivos em energia que não podem atender à demanda clínica atual de EVs6.
Os exossomos miméticos (EMs), substitutos sintéticos de EVs nativos, têm atraído atenção importante devido à sua estrutura, função e escalabilidade altamente semelhantes na produção. A principal fonte de MEs provém da extrusão direta de células parentais inteiras com secção contínua 9,10, demonstrando potentes funções biológicas como EVs nativas11,12. Por exemplo, os MEs derivados de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hUCMSCs) exercem efeitos de cicatrização semelhantes aos EVs nativos e são mais ricos em composição proteica13. Embora os MEs derivados de células inteiras tenham a complexidade biológica dos EVs, sua principal desvantagem é a heterogeneidade dos produtos, porque eles são inevitavelmente contaminados por várias organelas celulares e detritos celulares. A análise da localização de proteínas revelou ainda que os MEs derivados da extrusão de células inteiras contêm muitas proteínas não-EVs específicas da mitocôndria e do retículo endoplasmático13. Além disso, a maioria dos métodos de fabricação de MEs ainda requer ultracentrifugação, um processo altamente demorado e que consome energia14. Considerando o fato de que os exossomos são exclusivamente derivados de endossomos celulares, levantamos a hipótese de que nanovesículas derivadas de endossomos biomodificados podem recapitular melhor a homologia biológica entre exossomos e MEs em comparação com os MEs derivados da membrana celular bem estabelecidos produzidos pelo método de extrusão de célulasinteiras 14. No entanto, a fabricação de nanovesículas derivadas do endossomo é difícil devido à falta de abordagens viáveis.
Estudos clínicos têm sido realizados utilizando EVs como substituto da terapia livre de células e um sistema de liberação de fármacos em nanoescala para o tratamento de várias doenças. Por exemplo, EVs derivados de células-tronco mesenquimais da medula óssea foram usados para tratar pneumonia grave causada por COVID-19 e alcançaram resultados promissores. Recentemente, EVs geneticamente modificados carregando proteínas CD24 também demonstraram benefícios terapêuticos potentes para o tratamento de pacientes com COVID-1915,16. No entanto, a necessidade clínica da terapia EV ainda não pode ser atendida com os métodos tradicionais de isolamento, devido ao baixo rendimento e custo. Este estudo relata a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo através de uma abordagem de homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética. Ele aproveita a via de endocitose de MNPs para isolar endossomos carregados com MNP via separação magnética, seguida de homogeneização de alta velocidade para formular endossomos em nanovesículas monodispersas. Como os tipos de endossomos coletados por este protocolo são diversos, mais pesquisas ainda são necessárias para estabelecer boas práticas de fabricação (BPF) na indústria. Esta nova abordagem de preparação de EM é mais eficiente em termos de tempo (5 min de homogeneização de alta velocidade) para obter nanovesículas homólogas a EVs nativos. Produz exponencialmente mais vesículas a partir das mesmas quantidades de células do que a ultracentrifugação, que pode ser geralmente aplicada a vários tipos celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como substituto da terapia livre de células e de um sistema de liberação de fármacos em nanoescala, os EVs ainda não atenderam às suas expectativas clínicas, e um dos principais obstáculos é a falta de métodos escaláveis e reprodutíveis de produção e purificação6. Portanto, vários tipos de MEs têm sido desenvolvidos como análogos de EV com complexidade biológica semelhante14. Até o momento, o exemplo de EM mais comumente usado são as nanovesículas der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o uso de instrumentos no Shared Instrumentation Core Facility do Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Academia Chinesa de Ciências. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC; 82172598), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang, China (LZ22H310001), o Projeto de Treinamento de Talentos em Saúde 551 da Comissão de Saúde da Província de Zhejiang, China, o Projeto de Pesquisa de Desenvolvimento Agrícola e Social do Departamento Municipal de Ciência e Tecnologia de Hangzhou (2022ZDSJ0474) e a Bolsa de Pesquisa Interdisciplinar de Qiantang.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
