Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi
Summary
Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV’ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM’ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV’ler) fizyolojik ve patolojik araştırmalarda, hastalık teşhisinde ve tedavisinde büyük ilgi görmüştür; Bununla birlikte, klinik çevirileri, ölçek büyütme üretim yaklaşımlarının eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, bu protokol, geleneksel ultrasantrifüjleme yönteminden yaklaşık 100 kat daha yüksek verime sahip olan endozomlardan türetilen yeni bir eksozom taklitleri (EM’ler) türü olarak endozom türevli nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemi sağlar. Bu yöntemde, manyetik nanopartiküller (MNP’ler) ebeveyn hücreleri tarafından endositoz yoluyla içselleştirildi ve daha sonra endozomlarında biriktirildi. Daha sonra MNP yüklü endozomlar toplanarak hipotonik tedavi ve manyetik ayırma ile saflaştırıldı. MNP yüklü endozomları monodispers nanoveziküllere ayırmak için yüksek hızlı bir homojenizatör kullanıldı. Elde edilen endozom türevli veziküller, nanopartikül izleme analizi, transmisyon elektron mikroskobu ve western blotlama ile karakterize edilen aynı biyolojik kökene ve yapıya sahiptir. Morfolojileri ve protein bileşimleri doğal EV’lere benzer, bu da EM’lerin potansiyel olarak klinik çeviriler için yerel EV’lerin düşük maliyetli ve yüksek verimli bir vekili olarak hizmet edebileceğini gösterir.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV’ler), hemen hemen tüm hücreler tarafından salgılanan, 30-150 nm boyut aralığında, bol miktarda biyoaktif madde içeren küçük veziküllerdir. Orijin hücreye bağlı olarak, EV’ler yüksek heterojenlik gösterir ve ana hücrelere özgü birden fazla bileşene sahiptir1. EV’ler vücut sıvılarına salınır ve doku onarımı, tümör teşhisi ve tedavisi ve bağışıklık modülasyonu için çok çeşitli biyoaktif moleküller ve ilaçlar sağlamak için kullanılabileneylem 2 için hedef hücreler tarafından alındıkları uzak bölgelere taşınır 3,4. Bununla birlikte, vücut sıvılarında benzer biyofiziksel özelliklere sahip diğer biyolojik nanopartiküller (örneğin, lipoproteinler) ve nanoveziküller (örneğin, endozomal olmayan yollardan türetilen EV’ler) kaçınılmaz olarak EV izolasyonunu ve saflaştırılmasını etkiler. Bugüne kadar, ultrasantrifüjleme, EV izolasyonu için altın standart olmaya devam etmektedir ve sükroz yoğunluk gradyan santrifüjü, ultrafiltrasyon, polietilen glikol çökeltme, kromatografi ve immünomanyetik boncuk izolasyonu dahil olmak üzere diğer izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir5. EV terapötiklerinin klinik çevirisini ve ticarileştirilmesini sınırlayan mevcut darboğaz, EV’lerinyüksek düzeyde ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir izolasyonuna izin veren izolasyon tekniklerinin ciddi eksikliğidir 6,7,8. Geleneksel EV izolasyon teknikleri (örneğin, ultrasantrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisi) düşük verimden (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 hücre), uzun üretim döngüsünden (24-48 saat), ürün kalitesinin zayıf tekrarlanabilirliğinden muzdariptir ve EV’ler için mevcut klinik talebi karşılayamayan pahalı ve enerji yoğun üretim ekipmanı gerektirir6.
Yerel EV’lerin sentetik vekilleri olan eksozom taklitleri (EM’ler), üretimdeki oldukça benzer yapıları, işlevleri ve ölçeklenebilirlikleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. EM’lerin ana kaynağı, doğal EV’ler11,12 olarak güçlü biyolojik işlevler gösteren, sürekli kesitleme 9,10 ile tüm ebeveyn hücrelerinin doğrudan ekstrüzyonudur. Örneğin, insan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinden (hUCMSC’ler) türetilen EM’ler, doğal EV’lerle benzer yara iyileştirici etkiler gösterir ve protein bileşimi bakımından daha zengindir13. Tüm hücrelerden türetilen EM’ler, EV’lerin biyolojik karmaşıklığına sahip olsa da, ana dezavantajları, ürünlerin heterojenliğidir, çünkü kaçınılmaz olarak çeşitli hücresel organeller ve hücre kalıntıları tarafından kontamine olurlar. Protein lokalizasyon analizi ayrıca, tam hücre ekstrüzyonundan türetilen EM’lerin, mitokondri ve endoplazmik retikulumdan EV’lere özgü olmayan birçok protein içerdiğini ortaya koydu13. Ayrıca, EM’leri üretmek için kullanılan yöntemlerin çoğu, oldukça zaman ve enerji tüketen bir süreç olan ultrasantrifüjleme gerektirir14. Eksozomların yalnızca hücresel endozomlardan türetildiği gerçeğini göz önünde bulundurarak, biyomühendislik ürünü endozomdan türetilen nanoveziküllerin, tüm hücre ekstrüzyon yöntemi14 tarafından üretilen iyi kurulmuş hücre zarından türetilmiş EM’lere kıyasla eksozomlar ve EM’ler arasındaki biyolojik homolojiyi daha iyi özetleyebileceğini varsaydık. Bununla birlikte, endozom türevi nanoveziküllerin üretimi, uygulanabilir yaklaşımların olmaması nedeniyle zordur.
Klinik çalışmalar, çeşitli hastalıkların tedavisi için hücresiz tedavinin bir vekili ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sistemi olarak EV’ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örneğin, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden elde edilen EV’ler, COVID-19’un neden olduğu şiddetli pnömoniyi tedavi etmek için kullanılmış ve umut verici sonuçlar elde etmiştir. Son zamanlarda, CD24 proteinleri taşıyan genetiği değiştirilmiş EV’ler de COVID-19 hastalarının tedavisi için güçlü terapötik faydalar göstermiştir15,16. Bununla birlikte, EV tedavisinin klinik gereksinimi, düşük verim ve maliyet nedeniyle geleneksel izolasyon yöntemleriyle hala karşılanamamaktadır. Bu çalışma, manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yaklaşımı yoluyla endozom türevli nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimini bildirmektedir. MNP yüklü endozomları manyetik ayırma yoluyla izole etmek için MNP’lerin endositoz yolundan yararlanır, ardından endozomları monodispers nanoveziküller halinde formüle etmek için yüksek hızlı homojenizasyon yapar. Bu protokol tarafından toplanan endozom türleri çok çeşitli olduğundan, endüstride iyi üretim uygulamaları (GMP) oluşturmak için daha derinlemesine araştırmalara ihtiyaç vardır. Bu yeni EM hazırlama yaklaşımı, doğal EV’lere homolog nanoveziküller elde etmek için daha fazla zaman verimlidir (5 dakikalık yüksek hızlı homojenizasyon). Genellikle çeşitli hücre tiplerine uygulanabilen ultrasantrifüjlemeye göre aynı miktarda hücreden katlanarak daha fazla vezikül üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresiz terapinin ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sisteminin bir vekili olarak, EV’ler henüz klinik beklentilerini karşılamamıştır ve ana engel, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir üretim ve saflaştırma yöntemlerinin olmamasıdır6. Bu nedenle, benzer biyolojik karmaşıklığa sahip EV analogları olarak çeşitli EM türleri geliştirilmiştir14. Bugüne kadar, en yaygın kullanılan EM örneği, hücre plazma zarından türetilmiş nanoveziküllerdir. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Çin Bilimler Akademisi, Temel Tıp ve Kanser Enstitüsü’ndeki (IBMC) Paylaşılan Enstrümantasyon Çekirdek Tesisi’nde aletlerin kullanıldığını kabul ediyor. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC; 82172598), Çin’in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LZ22H310001), Çin’in Zhejiang Eyaleti Sağlık Komisyonu’nun 551 Sağlık Yeteneği Eğitim Projesi, Hangzhou Belediye Bilim ve Teknoloji Bürosu Tarımsal ve Sosyal Kalkınma Araştırma Projesi (2022ZDSJ0474) ve Qiantang Disiplinlerarası Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
