여기에서는 대형 식물의 유전적 형질전환에 대한 생체 내 연구를 위한 국소 진공 침투를 위한 첫 번째 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 사용하여 우리는 처음으로 카카오의 식물의 일시적인 변형에서 Agrobacterium을 매개 하는 것을 달성했습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
식물 형질전환의 일시적 형질전환은 식물 유전자 형질전환을 위한 빠르고 비용 효율적인 대안입니다. planta 형질전환을 위한 대부분의 프로토콜은 Agrobacterium 매개 형질전환의 사용에 의존합니다. 그러나 현재 사용 중인 프로토콜은 대형 플랜트를 진공 처리에 투입해야 하는 물리적, 경제적 제약으로 인해 소규모 플랜트에 대해 표준화되어 있습니다. 이 연구는 대형 플랜트에 맞춤화된 국부적인 진공 기반 농업 침투를 위한 효과적인 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법의 효능을 평가하기 위해, 우리는 유전자 변형에 난치하는 열대 식물 종인 카카오 식물에서 그 사용을 테스트했습니다. 우리의 프로토콜은 카카오 잎의 국부적인 공중 부분에 최대 0.07MPa의 진공을 반복적으로 적용할 수 있도록 허용하여 부착된 잎의 세포 간 공간으로 아그로박테리움의 침투를 강제할 수 있도록 했습니다. 그 결과, 우리는 RUBY 리포터 시스템에 대해 발현되는 부착된 카카오 잎의 질경이 변형에서 Agrobacterium-mediated transient를 달성했습니다. 이것은 또한 카카오의 식물의 일시적인 변형에서 최초의 Agrobacterium 매개 사례입니다. 이 프로토콜은 유사한 크기 제약을 가진 다른 식물 종에 진공 기반 농업 침투 방법을 적용할 수 있도록 하고 난치성 목본, 대형 종의 유전자 식물 내 특성 분석을 위한 문을 열 것입니다.
서론
식물의 유전자 형질전환 방법은 유전자의 생물학적 기능을 검사하는 데 필수적이며, 포스트 게놈 시대(post-genomic era)에 예측된 많은 수의 특성화되지 않은 유전자를 고려할 때 오늘날 특히 유용하다1. 이러한 방법은 완전히 형질전환된 라인을 얻거나 유전자를 일시적으로 발현하는 데 사용할 수 있습니다. 안정된 형질전환은 숙주가 채택한 외래 DNA가 숙주 게놈에 완전하고 비가역적으로 통합되고 유전자 변형이 다음 세대로 전달될 때 발생합니다. 일시적 형질전환(transient transformation)으로 알려진 일시적 발현은 아그로박테리움(Agrobacterium )에 의해 숙주 게놈에 통합되지 않은 세포로 전달된 T-DNA의 여러 사본에서 발생하며, 감염 후 2-4일 후에 최고조에 달한다2.
일시적 발현 분석은 종종 유전자의 기능적 특성 분석에 충분하며 안정적인 형질전환에 비해 몇 가지 이점을 제공할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 예를 들어, 일시적 형질전환은 조직 배양 기반 재생 절차가 필요하지 않습니다. 또 다른 장점은 애기장대(Arabidopsis thaliana
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. Agrobacterium tumefaciens 문화
- Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404의 전기 가능한 세포를 해동합니다.
- 효모 맥아(YM; 표 1) 육수를 17 mm x 100 mm 배양 튜브에 넣습니다. 나중을 위해 이 튜브를 보관하고 실온(RT)에 보관하십시오.
- 1.5mL 미세분리 튜브에 해동된 Agrobacterium 세포 30μL와 35S:RUBY를 포함하는 DNA 100-250ng(최대 5μL)를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
참고: 35S:RUBY 는 Yunde Zhao의 선물입니다. 샘플 아크를 방지하려면 이온 화합물의 존재를 최대한 줄이십시오. 이들 이온 화합물은 DNA(19)의 에탄올 침전으로부터 잔류 염일 수 있다. - 이 시점에서 얼음 위에 1mm 전기천공법 큐벳을 놓습니다.
- 이전 서스펜션 혼합물을 냉각된 1mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다. 모든 것을 얼음 위에 두십시오. 큐벳의 금속 전극을 닦습니다.
- electrop....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 프로토콜은 대형 목본 식물에 효과적인 농업 침투 방법을 제시합니다. 이 프로토콜을 통해 -0.07MPa의 진공 압력을 달성할 수 있었고, 그 결과 카카오 잎이 효과적이고 국부적으로 침투할 수 있었습니다. 그림 4에서는 침투 시스템 설정 프로세스를 관찰하고 그림 5에서는 최종 구성을 관찰합니다.
그림 4: 진공 챔버 설정.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 연구에서 우리는 카카오 식물을 예로 들어 목본 식물의 일 시적 변형을 위한 효율적이고 저렴한 농업 침투 프로토콜을 제시했습니다. 잎의 큐티클이 식물 조직의 변형을 나타낸다는 잘 알려진 제약을 감안할 때, 우리는 일반적으로 이 절차에 거부적인 목본 식물에서 진공에 의한 농업 침투를 촉진하는 전략을 개발하는 데 집중했습니다.
진공 챔버 내부의 진공 압력은 프로토콜의 주요 과제였던 데시케이터, 나뭇가지, 개스킷/O-링 및 데시케이터 뚜껑 사이에 생성된 작은 틈을 효율적으로 밀봉하고 메우기 덕분에 가능했습니다. 이러한 이유로 실리콘 인상재를 사용하여 브랜치를 데시케이터에 고정하는 것이 중요합니다. 이 물질은 비다공성이며 가지를 데시케이터와 개스킷에 부착할 수 있을 만큼 끈적끈적한 것으로 판명되었으며 화학적으로 불활성이므로 침투된 가지나 데시케이터가 손상되지 않습니다.
또한, 진공 펌프를 사용하여 잎 부분 내부의 압력 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Lic에게 감사드립니다. 헤수스 푸엔테스 곤잘레스(Jesús Fuentes González)와 네스토르 이반 로블레스 올리바레스(Néstor Iván Robles Olivares)는 비디오 촬영에 도움을 주었습니다. CIATEJ(테오브로마 카카오 식물)의 안토니아 구티에레스 모라(Antonia Gutierrez Mora) 박사의 관대한 기부에 감사드립니다. 또한 시설 지원에 대해 CIATEJ와 멕시코 Laboratorio Nacional PlanTECC에 감사드립니다. H.E.H.D. (CVU: 1135375)는 Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México(CONAHCYT)의 자금 지원을 받아 마스터 스터디를 수행했습니다. RUL은 Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco(COECYTJAL) 및 Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología(SICYT), Jalisco, México(Grant 7270-2018)의 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY 플라스미드 | 애드진 | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1mm 전기천공법 큐벳 | Thermo Fisher Scientific | FB101 | 피셔브랜드 Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| 동결 건조기 | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | YM 매체의 경우 0.38g/L 추가 |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| 만니톨 | 시그마 알드리치 | 63560-250G-F | YM 매체의 경우 10g/L 추가 |
| MES | 시그마 알드리치 | PHG0003 | (LB, YM 및 재현탁 매체의 경우) 1.95g/L(10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | 재현탁 매체의 경우 0.952g/L(10mM) 첨가 |
| MgSO4· 7H20 | 시그마 알드리치 | 63138-1KG | YM 매체용 0.204 g/L |
| 마이크로펄서 전기충격기 | Biorad 추가; | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | LB 매체의 경우 5g / L를 추가합니다. YM 매체의 경우 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계 | Thermo Fisher Scientific을 추가하십시오. | 13-400-518 | |
| 대통령 실리콘 인상 재료 | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| 실리콘 인상 재료 건 | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| 스트렙토마이신 | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| 카제인 | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | 매체의 경우 10g/L |
| 효모 추가 MCD | LAB | 9031 | 추출물, LB 매체의 경우 5g / L를 첨가하십시오. YM 매체의 경우 0.4g/L를 추가하십시오 |
참고문헌
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
