여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
조혈모세포이식(HSCT)에는 충분한 수의 치료용 조혈모세포/전구세포(HSPC)가 필요합니다. HSPC의 적절한 공급원을 확인하기 위해 생쥐의 대퇴골 근처 내부 근육 주머니에 재조합 인간 뼈 형태 유전 단백질-2(rhBMP-2)가 로드된 골격을 이식하여 생체 내 골 오가노이드를 개발했습니다. 이식 12주 후, in vivo osteo-organoids를 회수하고 HPSC에 대한 유세포 분석 분석을 수행하여 in vivo osteo-organoids 내에 HSPC subset이 유의하게 존재함을 밝혔습니다.
그런 다음 방사선을 통한 마우스의 조혈/면역체계 손상에 대한 치사하지 않는 모델을 확립하고 추출된 골오가노이드 유래 세포를 방사선 처리된 마우스의 말초 혈액에 주입하여 조혈모세포 이식(HSCT)을 수행했습니다. 조혈 회복의 효과는 혈액학적, 말초 혈액 키메라 및 고형 장기 키메라 분석을 통해 평가되었습니다. 그 결과, in vivo osteo-organoid 유래 세포가 방사선 조사된 마우스에서 손상된 말초 및 고체 면역 기관을 빠르고 효율적으로 재건할 수 있음을 확인했습니다. 이 접근법은 HSCT에 대한 HSPC의 대체 공급원으로서 잠재력을 가지고 있으며, 더 많은 환자에게 이점을 제공합니다.
서론
조혈모세포 이식은 다양한 혈액 악성 종양과 수많은 유전 및 자가면역 질환에 대한 전통적인 치료법입니다 1,2,3,4. 그럼에도 불구하고, 조혈모세포/전구세포(HSPC)의 제한된 수량과 기원은 조혈모세포이식(HSCT)의 임상적 시행에 실질적인 장애물로 부상하고 있습니다5,6.
대규모 체외 세포 증식은 치료용 세포를 채취하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다 5,7. 다양한 연구에서 일반적으로 자가 재생 작용제(예: 사이토카인 및 성장 인자)와 혈청 알부민의 조합을 사용하여 HSPC의 체외 팽창을 통해 HSPC가 체외에서 자가 재생하도록 자극하는 조건을 개발했습니다....
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프로토콜
8-10주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 연구에 포함되었습니다. 모든 쥐는 화동과학기술대학교(East China University of Science and Technology)의 동물 시설에 수용되었습니다. 모든 실험 절차는 화동과학기술대학교(East China University of Science and Technology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(ECUST-21010)의 승인을 받았습니다.
1. 생체 활성 비계의 제작
- 준비
- 세척 및 건조된 수술용 가위와 핀셋을 1,000mL 비커에 넣습니다. 비커의 입을 흡수지로 감싸고 면사로 단단히 묶습니다.
- 비커를 고압 살균기에 넣고 뚜껑을 단단히 닫고 살균 프로그램을 121분 동안 30°C로 설정하고 살균 프로그램을 시작합니다.
- 멸균 과정이 완료되면 멸균된 비커를 제거하고 60°C로 설정된 건조 오븐에 옮겨 건조시킵니다. 완전히 건조되면 비커에 75%(v/v) 알코올을 뿌리고 깨끗한 벤치에 놓습니다.
- 시술 2시간 전에 rhBMP-2 원액(1.0mg/mL)을 해동합니다.
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결과
프로토콜에 따라 멸균 상태에서 분해성 젤라틴 스펀지에 BMP-2를 떨어뜨려 생체 활성 골격을 만들었습니다. 그런 다음 골격을 마우스의 하지 근육에 이식하여 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 12주간의 잠복기 후, 골오가노이드에 대한 거시적 사진, 조직학적 분석 및 유세포 분석 분석을 수행했습니다(그림 1A). 젤라틴 스펀지를 5mm x 5mm x 5mm 크기의 입방체로 자르고 30μL의 BMP-2 원액(1.0mg/mL)을 흡수한 후 생체 활성 스캐폴드를 얻었습니다. 생체 활성 골격은 동결 건조 후에도 원래 모양을 유지했습니다(그림 1B). 주사 전자 현미경(SEM) 이미지는 세포 부착 및 증식을 촉진하는 생체 활성 골격 내의 다공성 구조를 보여줍니다(그림 1C). 다양한 기공 사이의 상호 연결은 혈관 발아 및 침입을 향상시켜 영양 수송을 촉진하여 세.......
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토론
이 프로토콜에서는 BMP-2가 로드된 젤라틴 스폰지 스캐폴드를 이식하여 골수와 같은 구조를 가진 in vivo osteo-organoids를 확립하는 접근 방식을 제시합니다. 당사는 이러한 in vivo osteo-organoids가 장기간(12주 이상)에 걸쳐 치료용 HSPC를 안정적으로 생산할 수 있음을 입증했습니다. 세포를 로드하는 기존의 체외 확장 또는 생체 내 배양 방법과 비교하여, 이 프로토콜은 HSPC 및 다양한 면역 세포를 포함한 다양한 세포 유형의 세포 칵테일을 3주 이내에 얻을 수 있습니다10. 동물 실험은 또한 in vivo osteo-organoid 유래 세포의 이식이 방사선 조사된 마우스의 조혈 회복을 가속화할 수 있음을 보여주었습니다. BMP-2가 적재된 젤라틴 스폰지가 -20 °C에서 보관하면 동결 건조 후 12개월 이상.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 기초과학센터 프로그램(제T2288102호), 중국국립자연과학재단의 핵심 프로그램(제32230059호), 중국국립자연과학재단(제32301123호), 물질생물학 및 동화학을 위한 프론티어 과학센터 재단(제호)의 지원을 받았다. JKVD1211002), 중국과학원의 Wego 프로젝트(No. (2020) 005), 상하이 국립중개의학시설(National Facility for Translational Medicine) 프로젝트(No. TMSK-2021-134) 및 중국 박사후 연구원 과학 재단(No. 2022M721147)의 지원을 받았습니다.
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재료
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| AF700-anti-Sca-1 (D7) | BioLegend | 108141 | 4 °C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200으로 희석합니다. |
| APC-anti-CD3e (145-2C11) | Tonbo | 20-0031-U100 | 4 °C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200을 희석하십시오. |
| bio-anti-CD34 (RAM34) | eBioscience | 13-0341-82 | 4 °C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200으로 희석합니다. |
| BV421-안티-CD127 (IL-7R&알파;) | BioLegend | 135023 | 4 °C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200을 희석합니다. |
| BV510-anti-CD48 (HM48-1) | BioLegend | 103443 | 4°C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200으로 희석합니다. |
| BV711-anti-CD16/32 (93) | BioLegend | 101337 | 4°C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200을 희석합니다. |
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| PE-Cy5-anti-c-kit (2B8) | BD Biosciences | 105809 | 4 >C. 염색을 위해 1:200으로 희석합니다. |
| PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2) | BioLegend | 103222 | 4°C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200으로 희석합니다. |
| PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115914 | 4°C에 보관하십시오. 염색을 위해 1:200을 희석합니다. |
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| rhBMP-2 | 상하이 Rebone Biomaterials Co. | 원액 내 rhBMP-2의 농도는 1.0mg/mL입니다. | |
| 염색 완충액 | BioLegend | 420201 | 4°C에서 보관합니다. |
| Xylene | GENERAL-REAGENT | 01018114 | |
| Zombie UV Fixable Viability Kit (6.2.5에 사용) | BioLegend | 423108 | 살아있는/죽은 염색 키트. 재구성을 위해 키트를 실온으로 가져오십시오. 100 µ 추가; 완전히 용해될 때까지 Zombie UV 염료 한 바이알에 DMSO의 L. |
참고문헌
- Copelan, E. A. Hematopoietic stem-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 354 (17), 1813-1826 (2006).
- Vittayawacharin, P., et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation for a patient with multiple autoimmune....
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