عرض توضيحي لثقافة ورقة الخلايا المجمعة ذاتيا والتوليد اليدوي لوتر 3D / الأربطة الشبيهة بالعضوية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية
Summary
هنا ، نعرض نموذجا عضويا من ثلاث خطوات (توسع ثنائي الأبعاد [2D] ، تحفيز ثنائي الأبعاد ، نضج ثلاثي الأبعاد [3D]) يقدم أداة واعدة للبحث الأساسي في الأوتار وطريقة محتملة خالية من السقالات لهندسة أنسجة الأوتار.
Abstract
الأوتار والأربطة (T / L) هي هياكل قوية منظمة هرميا توحد الجهاز العضلي الهيكلي. تحتوي هذه الأنسجة على مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين من النوع الأول (ECM) وخلايا سلالة T / L مرتبة بشكل أساسي في صفوف متوازية. بعد الإصابة ، يتطلب T / L وقتا طويلا لإعادة التأهيل مع مخاطر فشل عالية ونتائج إصلاح غير مرضية في كثير من الأحيان. على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث بيولوجيا T / L ، فإن أحد التحديات المتبقية هو أن مجال T / L لا يزال يفتقر إلى بروتوكول تمايز موحد قادر على تلخيص عملية تكوين T / L في المختبر. على سبيل المثال ، يتطلب تمايز العظام والدهون لخلايا السلائف الوسيطة فقط زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية (2D) وإضافة وسائط تحفيز محددة. للتمايز مع الغضاريف ، من الضروري زراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد (3D) ومكملات TGFß. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا إلى الأوتار يحتاج إلى نموذج ثقافة 3D منظم للغاية ، والذي يجب أن يكون مثاليا أيضا خاضعا للتحفيز الميكانيكي الديناميكي. لقد أنشأنا نموذجا عضويا من 3 خطوات (التوسع والتحفيز والنضج) لتشكيل هيكل يشبه قضيب 3D من ورقة خلية مجمعة ذاتيا ، والتي توفر بيئة دقيقة طبيعية مع عوامل ECM و autocrine و paracrine الخاصة بها. تتميز هذه الكائنات العضوية الشبيهة بالقضيب ببنية خلوية متعددة الطبقات داخل ECM الغنية ويمكن التعامل معها بسهولة تامة للتعرض للإجهاد الميكانيكي الثابت. هنا ، أظهرنا البروتوكول المكون من 3 خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية المتاحة تجاريا. يمكننا أن نظهر أن هذا النوع من الخلايا يشكل عضويات قوية ووفيرة من ECM. يمكن تحسين الإجراء الموصوف بشكل أكبر من حيث وسائط الثقافة وتحسينه نحو التحفيز الميكانيكي المحوري الديناميكي. بنفس الطريقة ، يمكن اختبار مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وبالتالي الخضوع لتمايز T / L. باختصار ، يمكن استخدام نهج 3D T / L العضوي المعمول به كنموذج للبحوث الأساسية للأوتار وحتى لهندسة T / L الخالية من السقالات.
Introduction
الأوتار والأربطة (T / L) هي مكونات حيوية للجهاز العضلي الهيكلي التي توفر الدعم الأساسي والاستقرار للجسم. على الرغم من دورها الحاسم ، فإن هذه الأنسجة الضامة عرضة للانحطاط والإصابة ، مما يسبب الألم وضعف الحركة1. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي إمدادهم المحدود بالدم وقدرتهم البطيئة على الشفاء إلى إصابات مزمنة ، في حين أن عوامل مثل الشيخوخة والحركة المتكررة وإعادة التأهيل غير السليمة تزيد من خطر التنكس والإصابة2. العلاجات التقليدية ، مثل الراحة والعلاج الطبيعي والتدخلات الجراحية ، غير قادرة على استعادة هيكل T / L ووظيفته بالكامل. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سعى الباحثون إلى فهم الطبيعة المعقدة ل T / L بشكل أفضل من أجل البحث عن علاجات فعالة لاضطرابات T / L3،4،5. تتميز T / L بهيكل منظم هرميا تهيمن عليه مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، يتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين من النوع الأول والبروتيوغليكان ، وهي ميزة يصعب تكرارها في المختبر6. تفشل نماذج زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التقاط التنظيم الثلاثي الأبعاد (3D) المميز لأنسجة T / L ، مما يحد من إمكاناتها الانتقالية بالإضافة إلى إعاقة التقدم المبتكر في مجال تجديد T / L.
في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير نماذج 3D العضوية إمكانيات جديدة لتطوير البحوث الأساسية وهندسة الأنسجة الخالية من السقالات من أنواع الأنسجةالمختلفة 7،8،9،10،11،12،13. على سبيل المثال ، للتحقيق في تقاطع الأوتار العضلية ، طور Larkin et al. 2006 تركيبات العضلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع شرائح الأوتار ذاتية التنظيم المشتقة من وتر ذيل الفئران10. علاوة على ذلك ، قام Schiele et al. 2013 ، باستخدام قنوات النمو المغلفة بالفبرونيكتين الدقيقة ، بتوجيه التجميع الذاتي للخلايا الليفية الجلدية البشرية لتشكيل ألياف خلوية دون مساعدة سقالة ثلاثية الأبعاد ، وهو نهج يمكنه التقاط السمات الرئيسية لتطور الأوتار الجنينية11. في الدراسة التي أجراها Florida et al. 2016 ، تم توسيع خلايا انسجة نخاع العظم لأول مرة إلى سلالات العظام والأربطة ، واستخدمت بعد ذلك لتوليد صفائح خلايا أحادية الطبقة مجمعة ذاتيا ، والتي تم تنفيذها بعد ذلك لإنشاء بنية عظمية متعددة الأطوار للأربطة والعظام تحاكي الرباط الصليبي الأمامي الأصلي ، وهو نموذج يهدف إلى تحسين فهم تجديد الرباط12. لتوضيح عمليات النقل الميكانيكي للوتر ، استخدم Mubyana et al. 2018 منهجية خالية من السقالات تم من خلالها إنشاء ألياف وتر واحد وإخضاعها لبروتوكول التحميلالميكانيكي 13. Organoids هي هياكل 3D ذاتية التنظيم تحاكي العمارة الأصلية والبيئة المكروية ووظائف الأنسجة. توفر الثقافات العضوية 3D نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة بيولوجيا الأنسجة والأعضاء وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. يمكن أيضا استخدام هذه النماذج للحث على التمايز الخاص بالأنسجة لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية / السلفية14,15. وبالتالي ، فإن تنفيذ نماذج 3D العضوية في مجال بيولوجيا T / L وهندسة الأنسجة يصبح نهجا جذابا للغاية 9,16. يمكن تنفيذ مصادر الخلايا البديلة لتجميع العضوي وتحفيزها نحو التمايز التينوجيني. أحد أنواع الخلايا ذات الصلة المستخدمة للتوضيح في هذه الدراسة هو الخلايا الليفية الجلدية7،17،18. يمكن الوصول إلى هذه الخلايا بسهولة من خلال إجراء خزعة الجلد ، وهو أقل توغلا مقارنة بثقب نخاع العظم أو شفط الدهون ويمكن مضاعفتها بسرعة إلى حد ما إلى أعداد كبيرة بسبب قدرتها التكاثرية الجيدة. في المقابل ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ، مثل الخلايا الليفية المقيمة T / L ، أكثر صعوبة في العزل والتوسع. لذلك ، تم استخدام الخلايا الليفية الجلدية أيضا كنقطة انطلاق لتقنيات إعادة برمجة الخلايا نحو الخلايا الجذعية الجنينية المستحثةمتعددة القدرات 19. إن إخضاع الخلايا الليفية الجلدية لظروف ثقافة ثلاثية الأبعاد محددة وإشارات إشارات ، مثل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGFß3) ، والذي تم الإبلاغ عن أنه يعمل كمنظم رئيسي للعمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك تكوين وصيانة T / L ، يمكن أن يحفز تمايزها في المختبر مما يؤدي إلى التعبير عن جينات خاصة بالوتر وترسب T / L-typical ECM20 ، 21.
هنا ، نصف ونوضح بروتوكولا عضويا تم إنشاؤه وتنفيذه مسبقا من 3 خطوات (توسع ثنائي الأبعاد ، وتحفيز ثنائي الأبعاد ، ونضج ثلاثي الأبعاد) باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية العادية للبالغين (NHDFs) المتاحة تجاريا كمصدر للخلايا ، مما يقدم نموذجا قيما للدراسة في تكوين الوتر في المختبر 7. على الرغم من حقيقة أن هذا النموذج لا يعادل أنسجة T / L في الجسم الحي ، إلا أنه لا يزال يوفر نظاما أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه للتحقيق في آليات التمايز الخلوي ، ومحاكاة الفيزيولوجيا المرضية T / L في المختبر ، وإنشاء T / L الطب الشخصي ومنصات فحص الأدوية. علاوة على ذلك ، في المستقبل ، يمكن للدراسات تقييم ما إذا كانت المواد العضوية 3D مناسبة لهندسة T / L الخالية من السقالات من خلال مزيد من التحسين وكذلك قابلة للاستخدام لتطوير تركيبات قوية ميكانيكيا موسعة تشبه إلى حد كبير الأبعاد والخصائص الهيكلية والفيزيائية الحيوية لأنسجة T / L الأصلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر النتائج الموضحة في هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء وتوصيف نموذج NHDF 3D العضوي لدراسة أنسجة T / L. أدى البروتوكول المكون من 3 خطوات إلى تكوين عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد تظهر ميزات نموذجية لمكانة T / L. تم الإبلاغ عن هذا النموذج سابقا في Kroner-Weigl et al. 20237 وتم عرضه بتفصيل كبير ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
د. د. و س. م. د. الاعتراف بمنحة BMBF “CellWiTaL: أنظمة الخلايا القابلة للتكرار لأبحاث الأدوية – نقل الطباعة بالليزر الخالية من الطبقات لخلايا مفردة محددة للغاية في هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد” الاقتراح رقم 13N15874. D.D. و V.R.A. تعترف بمنحة EU MSCA-COFUND OSTASKILLS “التدريب الشامل للجيل القادم من أبحاث هشاشة العظام” GA Nr. 101034412. ويعرب جميع المؤلفين عن تقديرهم للسيدة بيت غيير لما قدمته من مساعدة تقنية.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
