هنا ، نعرض نموذجا عضويا من ثلاث خطوات (توسع ثنائي الأبعاد [2D] ، تحفيز ثنائي الأبعاد ، نضج ثلاثي الأبعاد [3D]) يقدم أداة واعدة للبحث الأساسي في الأوتار وطريقة محتملة خالية من السقالات لهندسة أنسجة الأوتار.
الأوتار والأربطة (T / L) هي هياكل قوية منظمة هرميا توحد الجهاز العضلي الهيكلي. تحتوي هذه الأنسجة على مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين من النوع الأول (ECM) وخلايا سلالة T / L مرتبة بشكل أساسي في صفوف متوازية. بعد الإصابة ، يتطلب T / L وقتا طويلا لإعادة التأهيل مع مخاطر فشل عالية ونتائج إصلاح غير مرضية في كثير من الأحيان. على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث بيولوجيا T / L ، فإن أحد التحديات المتبقية هو أن مجال T / L لا يزال يفتقر إلى بروتوكول تمايز موحد قادر على تلخيص عملية تكوين T / L في المختبر. على سبيل المثال ، يتطلب تمايز العظام والدهون لخلايا السلائف الوسيطة فقط زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية (2D) وإضافة وسائط تحفيز محددة. للتمايز مع الغضاريف ، من الضروري زراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد (3D) ومكملات TGFß. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا إلى الأوتار يحتاج إلى نموذج ثقافة 3D منظم للغاية ، والذي يجب أن يكون مثاليا أيضا خاضعا للتحفيز الميكانيكي الديناميكي. لقد أنشأنا نموذجا عضويا من 3 خطوات (التوسع والتحفيز والنضج) لتشكيل هيكل يشبه قضيب 3D من ورقة خلية مجمعة ذاتيا ، والتي توفر بيئة دقيقة طبيعية مع عوامل ECM و autocrine و paracrine الخاصة بها. تتميز هذه الكائنات العضوية الشبيهة بالقضيب ببنية خلوية متعددة الطبقات داخل ECM الغنية ويمكن التعامل معها بسهولة تامة للتعرض للإجهاد الميكانيكي الثابت. هنا ، أظهرنا البروتوكول المكون من 3 خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية المتاحة تجاريا. يمكننا أن نظهر أن هذا النوع من الخلايا يشكل عضويات قوية ووفيرة من ECM. يمكن تحسين الإجراء الموصوف بشكل أكبر من حيث وسائط الثقافة وتحسينه نحو التحفيز الميكانيكي المحوري الديناميكي. بنفس الطريقة ، يمكن اختبار مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وبالتالي الخضوع لتمايز T / L. باختصار ، يمكن استخدام نهج 3D T / L العضوي المعمول به كنموذج للبحوث الأساسية للأوتار وحتى لهندسة T / L الخالية من السقالات.
الأوتار والأربطة (T / L) هي مكونات حيوية للجهاز العضلي الهيكلي التي توفر الدعم الأساسي والاستقرار للجسم. على الرغم من دورها الحاسم ، فإن هذه الأنسجة الضامة عرضة للانحطاط والإصابة ، مما يسبب الألم وضعف الحركة1. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي إمدادهم المحدود بالدم وقدرتهم البطيئة على الشفاء إلى إصابات مزمنة ، في حين أن عوامل مثل الشيخوخة والحركة المتكررة وإعادة التأهيل غير السليمة تزيد من خطر التنكس والإصابة2. العلاجات التقليدية ، مثل الراحة والعلاج الطبيعي والتدخلات الجراحية ، غير قادرة على استعادة هيكل T / L ووظيفته بالكامل. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سعى الباحثون إلى فهم الطبيعة المعقدة ل T / L بشكل أفضل من أجل البحث عن علاجات فعالة لاضطرابات T / L3،4،5. تتميز T / L بهيكل منظم هرميا تهيمن عليه مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، يتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين من النوع الأول والبروتيوغليكان ، وهي ميزة يصعب تكرارها في المختبر6. تفشل نماذج زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التقاط التنظيم الثلاثي الأبعاد (3D) المميز لأنسجة T / L ، مما يحد من إمكاناتها الانتقالية بالإضافة إلى إعاقة التقدم المبتكر في مجال تجديد T / L.
في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير نماذج 3D العضوية إمكانيات جديدة لتطوير البحوث الأساسية وهندسة الأنسجة الخالية من السقالات من أنواع الأنسجةالمختلفة 7،8،9،10،11،12،13. على سبيل المثال ، للتحقيق في تقاطع الأوتار العضلية ، طور Larkin et al. 2006 تركيبات العضلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع شرائح الأوتار ذاتية التنظيم المشتقة من وتر ذيل الفئران10. علاوة على ذلك ، قام Schiele et al. 2013 ، باستخدام قنوات النمو المغلفة بالفبرونيكتين الدقيقة ، بتوجيه التجميع الذاتي للخلايا الليفية الجلدية البشرية لتشكيل ألياف خلوية دون مساعدة سقالة ثلاثية الأبعاد ، وهو نهج يمكنه التقاط السمات الرئيسية لتطور الأوتار الجنينية11. في الدراسة التي أجراها Florida et al. 2016 ، تم توسيع خلايا انسجة نخاع العظم لأول مرة إلى سلالات العظام والأربطة ، واستخدمت بعد ذلك لتوليد صفائح خلايا أحادية الطبقة مجمعة ذاتيا ، والتي تم تنفيذها بعد ذلك لإنشاء بنية عظمية متعددة الأطوار للأربطة والعظام تحاكي الرباط الصليبي الأمامي الأصلي ، وهو نموذج يهدف إلى تحسين فهم تجديد الرباط12. لتوضيح عمليات النقل الميكانيكي للوتر ، استخدم Mubyana et al. 2018 منهجية خالية من السقالات تم من خلالها إنشاء ألياف وتر واحد وإخضاعها لبروتوكول التحميلالميكانيكي 13. Organoids هي هياكل 3D ذاتية التنظيم تحاكي العمارة الأصلية والبيئة المكروية ووظائف الأنسجة. توفر الثقافات العضوية 3D نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة بيولوجيا الأنسجة والأعضاء وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. يمكن أيضا استخدام هذه النماذج للحث على التمايز الخاص بالأنسجة لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية / السلفية14,15. وبالتالي ، فإن تنفيذ نماذج 3D العضوية في مجال بيولوجيا T / L وهندسة الأنسجة يصبح نهجا جذابا للغاية 9,16. يمكن تنفيذ مصادر الخلايا البديلة لتجميع العضوي وتحفيزها نحو التمايز التينوجيني. أحد أنواع الخلايا ذات الصلة المستخدمة للتوضيح في هذه الدراسة هو الخلايا الليفية الجلدية7،17،18. يمكن الوصول إلى هذه الخلايا بسهولة من خلال إجراء خزعة الجلد ، وهو أقل توغلا مقارنة بثقب نخاع العظم أو شفط الدهون ويمكن مضاعفتها بسرعة إلى حد ما إلى أعداد كبيرة بسبب قدرتها التكاثرية الجيدة. في المقابل ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ، مثل الخلايا الليفية المقيمة T / L ، أكثر صعوبة في العزل والتوسع. لذلك ، تم استخدام الخلايا الليفية الجلدية أيضا كنقطة انطلاق لتقنيات إعادة برمجة الخلايا نحو الخلايا الجذعية الجنينية المستحثةمتعددة القدرات 19. إن إخضاع الخلايا الليفية الجلدية لظروف ثقافة ثلاثية الأبعاد محددة وإشارات إشارات ، مثل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGFß3) ، والذي تم الإبلاغ عن أنه يعمل كمنظم رئيسي للعمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك تكوين وصيانة T / L ، يمكن أن يحفز تمايزها في المختبر مما يؤدي إلى التعبير عن جينات خاصة بالوتر وترسب T / L-typical ECM20 ، 21.
هنا ، نصف ونوضح بروتوكولا عضويا تم إنشاؤه وتنفيذه مسبقا من 3 خطوات (توسع ثنائي الأبعاد ، وتحفيز ثنائي الأبعاد ، ونضج ثلاثي الأبعاد) باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية العادية للبالغين (NHDFs) المتاحة تجاريا كمصدر للخلايا ، مما يقدم نموذجا قيما للدراسة في تكوين الوتر في المختبر 7. على الرغم من حقيقة أن هذا النموذج لا يعادل أنسجة T / L في الجسم الحي ، إلا أنه لا يزال يوفر نظاما أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه للتحقيق في آليات التمايز الخلوي ، ومحاكاة الفيزيولوجيا المرضية T / L في المختبر ، وإنشاء T / L الطب الشخصي ومنصات فحص الأدوية. علاوة على ذلك ، في المستقبل ، يمكن للدراسات تقييم ما إذا كانت المواد العضوية 3D مناسبة لهندسة T / L الخالية من السقالات من خلال مزيد من التحسين وكذلك قابلة للاستخدام لتطوير تركيبات قوية ميكانيكيا موسعة تشبه إلى حد كبير الأبعاد والخصائص الهيكلية والفيزيائية الحيوية لأنسجة T / L الأصلية.
توفر النتائج الموضحة في هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء وتوصيف نموذج NHDF 3D العضوي لدراسة أنسجة T / L. أدى البروتوكول المكون من 3 خطوات إلى تكوين عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد تظهر ميزات نموذجية لمكانة T / L. تم الإبلاغ عن هذا النموذج سابقا في Kroner-Weigl et al. 20237 وتم عرضه بتفصيل كبير ?…
The authors have nothing to disclose.
د. د. و س. م. د. الاعتراف بمنحة BMBF “CellWiTaL: أنظمة الخلايا القابلة للتكرار لأبحاث الأدوية – نقل الطباعة بالليزر الخالية من الطبقات لخلايا مفردة محددة للغاية في هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد” الاقتراح رقم 13N15874. D.D. و V.R.A. تعترف بمنحة EU MSCA-COFUND OSTASKILLS “التدريب الشامل للجيل القادم من أبحاث هشاشة العظام” GA Nr. 101034412. ويعرب جميع المؤلفين عن تقديرهم للسيدة بيت غيير لما قدمته من مساعدة تقنية.
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |