הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים
Summary
כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.
Abstract
גידים ורצועות (T/L) הם מבנים חזקים המאורגנים היררכית המאחדים את מערכת השלד והשרירים. לרקמות אלה יש מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן מסוג I (ECM) ותאי שושלת T/L המסודרים בקפידה הממוקמים בעיקר בשורות מקבילות. לאחר פציעה, T/L דורשים זמן רב לשיקום עם סיכון גבוה לכישלון ולעתים קרובות תוצאות תיקון לא משביעות רצון. למרות ההתקדמות האחרונה במחקר הביולוגיה של T/L, אחד האתגרים שנותרו הוא שבתחום T/L עדיין חסר פרוטוקול התמיינות סטנדרטי המסוגל לשחזר את תהליך היווצרות T/L במבחנה. לדוגמה, התמיינות עצם ושומן של תאים מקדימים מזנכימליים דורשת רק תרבית תאים דו-ממדית סטנדרטית (2D) ותוספת של אמצעי גירוי ספציפיים. לצורך התמיינות לסחוס, יש צורך בתרבית כדוריות תלת מימדית (תלת מימדית) ותוספת של TGFß. עם זאת, התמיינות תאים לגיד דורשת מודל תרבית תלת ממדי מסודר מאוד, אשר באופן אידיאלי צריך להיות נתון גם לגירוי מכני דינמי. הקמנו מודל אורגנואיד בן 3 שלבים (הרחבה, גירוי והתבגרות) כדי ליצור מבנה דמוי מוט תלת-ממדי מתוך יריעת תאים בהרכבה עצמית, המספקת מיקרו-סביבה טבעית עם גורמי ECM, אוטוקרינים ופרקריניים משלה. לאורגנואידים דמויי מוטות אלה יש ארכיטקטורה תאית רב-שכבתית בתוך ECM עשיר וניתן לטפל בהם די בקלות לחשיפה למתח מכני סטטי. כאן, הדגמנו את פרוטוקול 3 השלבים באמצעות פיברובלסטים עוריים הזמינים באופן מסחרי. אנו יכולים להראות שסוג התא הזה יוצר אורגנואידים חזקים ושופעי ECM. ההליך המתואר יכול להיות ממוטב עוד יותר במונחים של מדיה תרבותית ואופטימיזציה לקראת גירוי מכני צירי דינמי. באותו אופן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיבדק עבור הפוטנציאל שלהם ליצור אורגנואידים T / L ובכך לעבור התמיינות T / L. לסיכום, הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי של גידים ואפילו להנדסת T/L ללא פיגומים.
Introduction
גידים ורצועות (T/L) הם מרכיבים חיוניים של מערכת השלד והשרירים המספקים תמיכה חיונית ויציבות לגוף. למרות תפקידן הקריטי, רקמות חיבור אלה מועדות להתנוונות ולפציעות, הגורמות לכאב ולפגיעה בניידות1. יתר על כן, אספקת הדם המוגבלת שלהם ויכולת הריפוי האיטית שלהם עלולים להוביל לפציעות כרוניות, בעוד שגורמים כגון הזדקנות, תנועה חוזרת ונשנית ושיקום לא תקין מגבירים עוד יותר את הסיכון לניוון ופציעה2. טיפולים קונבנציונליים, כגון מנוחה, פיזיותרפיה והתערבויות כירורגיות, אינם מסוגלים לשחזר באופן מלא את המבנה והתפקוד של T/L. במהלך השנים האחרונות, חוקרים שאפו להבין טוב יותר את האופי המורכב של T / L על מנת לחפש טיפולים יעילים להפרעות T / L 3,4,5. T/L נבדלים על ידי מבנה מאורגן היררכית, מטריצה חוץ-תאית (ECM), המורכב בעיקר מסיבי קולגן מסוג I ופרוטאוגליקנים, תכונה שקשה לשכפל במבחנה6. מודלים מסורתיים של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) אינם מצליחים ללכוד את הארגון התלת-ממדי (3D) האופייני של רקמות T/L, ומגבילים את פוטנציאל התרגום שלהם, כמו גם מעכבים את ההתקדמות החדשנית בתחום התחדשות T/L.
לאחרונה, הפיתוח של מודלים אורגנואידים תלת-ממדיים הציע אפשרויות חדשות לקידום מחקר בסיסי והנדסת רקמות ללא פיגומים של סוגי רקמות שונים 7,8,9,10,11,12,13. לדוגמה, כדי לחקור צומת מיוטנדי, Larkin et al. 2006 פיתחו מבני שרירי שלד תלת-ממדיים יחד עם מקטעי גידים מאורגנים עצמיים הנגזרים מגיד זנב חולדה10. יתר על כן, שילה ועמיתיו 2013, באמצעות שימוש בתעלות גידול מצופות פיברונקטין במיקרו-מכונה, כיוונו את ההרכבה העצמית של פיברובלסטים עוריים אנושיים ליצירת סיבים תאיים ללא סיוע של פיגומים תלת-ממדיים, גישה שיכולה ללכוד תכונות מפתח של התפתחות גידים עובריים11. במחקר שנערך על ידי Florida et al. 2016, תאי סטרומה ממח עצם הורחבו תחילה לשושלות עצם ורצועות, ולאחר מכן שימשו ליצירת יריעות תאים חד-שכבתיות בהרכבה עצמית, אשר יושמו לאחר מכן ליצירת מבנה רב-פאזי של עצם-רצועה-עצם המחקה את הרצועה הצולבת הקדמית הטבעית, מודל שמטרתו לשפר את ההבנה של התחדשות רצועות12. כדי להבהיר תהליכי מכנוטרנסדוקציה של גידים, Mubyana et al. 2018 השתמשו במתודולוגיה נטולת פיגומים שבאמצעותה נוצרו סיבי גיד בודדים ונתונים לפרוטוקול העמסה מכני13. אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים בעצמם המחקים את הארכיטקטורה המקורית, המיקרו-סביבה והפונקציונליות של רקמות. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות מספקות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר ביולוגיה של רקמות ואיברים, כמו גם פתופיזיולוגיה. מודלים כאלה יכולים לשמש גם כדי לגרום להתמיינות ספציפית לרקמות של סוגי תאי גזע / אב שונים14,15. לפיכך, יישום מודלים אורגנואידים תלת ממדיים בתחום הביולוגיה T/L והנדסת רקמות הופך לגישה אטרקטיבית מאוד 9,16. מקורות תאים חלופיים יכולים להיות מיושמים עבור הרכבת אורגנואידים ולעורר לקראת התמיינות טנוגנית. סוג תא רלוונטי אחד המשמש להדגמה במחקר זה הוא פיברובלסטים עוריים 7,17,18. תאים אלה נגישים בקלות באמצעות הליך ביופסיה של העור, שהוא פחות פולשני בהשוואה לניקוב מח עצם או שאיבת שומן וניתן להכפיל אותם די מהר למספרים גדולים בשל יכולת ההתרבות הטובה שלהם. לעומת זאת, סוגי תאים מיוחדים יותר, כגון פיברובלסטים תושבי T/L, מאתגרים יותר לבידוד והרחבה. לכן, פיברובלסטים עוריים שימשו גם כנקודת מוצא לטכנולוגיות תכנות מחדש של תאים לקראת תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים מושרים19. חשיפת פיברובלסטים עוריים לתנאי תרבית תלת-ממדיים ספציפיים ולרמזי איתות, כגון טרנספורמציה של גורם גדילה-בטא 3 (TGFß3), אשר דווח כי הוא פועל כמווסת מרכזי של תהליכים תאיים שונים, כולל היווצרות ותחזוקה של T/L, יכול להגביר את ההתמיינות הטנוגנית שלהם במבחנה המובילה לביטוי גנים ספציפיים לגידים ולשקיעת T/L-טיפוסי ECM20, 21.
כאן, אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול אורגנואיד תלת-שלבי שהוקם ויושם בעבר (הרחבה דו-ממדית, גירוי דו-ממדי והבשלה תלת-ממדית) תוך שימוש בפיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים בוגרים (NHDFs) הזמינים מסחרית כמקור תא, ומציע מודל רב ערך לחקר טנוגנזה במבחנה 7. למרות העובדה שמודל זה אינו שווה ערך לרקמת In vivo T/L, הוא עדיין מספק מערכת רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שניתן להשתמש בה לחקר מנגנוני התמיינות תאית, חיקוי פתופיזיולוגיה של T/L במבחנה, והקמת פלטפורמות לרפואה מותאמת אישית וסינון תרופות. יתר על כן, בעתיד, מחקרים יכולים להעריך אם אורגנואידים תלת-ממדיים מתאימים להנדסת T/L נטולת פיגומים על ידי אופטימיזציה נוספת, כמו גם ניתנים לשימוש לפיתוח מבנים חזקים מבחינה מכנית בקנה מידה הדומים מאוד לממדים ולתכונות המבניות והביופיזיות של רקמות T/L מקוריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאות שהודגמו במחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי ביסוס ואפיון מודל האורגנואיד התלת-ממדי NHDF לחקר רקמות T/L. פרוטוקול 3 השלבים הוביל להיווצרות אורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי המציגים תכונות אופייניות של נישת T/L. מודל זה דווח בעבר ב- Kroner-Weigl et al. 20237 והודגם בפירוט רב כאן.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד.ד. וש.מ.-ד. הכירו במענק BMBF “CellWiTaL: מערכות תאים ניתנות לשכפול למחקר תרופתי – הדפסת לייזר ללא שכבת העברה של תאים בודדים ספציפיים מאוד במבנים תאיים תלת ממדיים” הצעה מס’ 13N15874. D.D. ו- V.R.A. מכירים במענק EU MSCA-COFUND OSTASKILLS “הכשרה הוליסטית של מחקרי אוסטאוארתריטיס מהדור הבא”, GA Nr. 101034412. כל המחברים מודים לגברת ביאטה גייר על הסיוע הטכני.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
