Demonstrasjon av selvmontert cellearkkultur og manuell generering av en 3D-sene / ligamentlignende organoid ved bruk av humane dermale fibroblaster
Summary
Her demonstrerer vi en tre-trinns organoidmodell (todimensjonal [2D] ekspansjon, 2D-stimulering, tredimensjonal [3D] modning) som tilbyr et lovende verktøy for senegrunnforskning og en potensiell stillasfri metode for senevevsteknikk.
Abstract
Sener og leddbånd (T/L) er sterke hierarkisk organiserte strukturer som forener muskel- og skjelettsystemet. Disse vevene har en strengt arrangert kollagen type I-rik ekstracellulær matrise (ECM) og T / L-avstamningsceller hovedsakelig plassert i parallelle rader. Etter skade krever T/L lang tid for rehabilitering med høy sviktrisiko og ofte utilfredsstillende reparasjonsresultater. Til tross for nylige fremskritt innen T / L-biologisk forskning, er en av de gjenværende utfordringene at T / L-feltet fortsatt mangler en standardisert differensieringsprotokoll som er i stand til å rekapitulere T / L-dannelsesprosessen in vitro. For eksempel krever ben- og fettdifferensiering av mesenkymale forløperceller bare standard todimensjonal (2D) cellekultur og tilsetning av spesifikke stimuleringsmedier. For differensiering til brusk er tredimensjonal (3D) pelletskultur og tilskudd av TGFß nødvendig. Imidlertid trenger celledifferensiering til sene en veldig ryddig 3D-kulturmodell, som ideelt sett også bør utsettes for dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etablert en 3-trinns (ekspansjon, stimulering og modning) organoidmodell for å danne en 3D-stavlignende struktur ut av et selvmontert celleark, som leverer et naturlig mikromiljø med sine egne ECM-, autokrine og parakrine faktorer. Disse stavlignende organoidene har en flerlags cellulær arkitektur i rik ECM og kan håndteres ganske enkelt for eksponering for statisk mekanisk belastning. Her demonstrerte vi 3-trinns protokollen ved å bruke kommersielt tilgjengelige dermale fibroblaster. Vi kunne vise at denne celletypen danner robuste og ECM-rike organoider. Den beskrevne prosedyren kan optimaliseres ytterligere når det gjelder kulturmedier og optimaliseres mot dynamisk aksial mekanisk stimulering. På samme måte kan alternative cellekilder testes for deres potensial til å danne T / L-organoider og dermed gjennomgå T / L-differensiering. I sum kan den etablerte 3D T / L organoide tilnærmingen brukes som en modell for senegrunnforskning og til og med for stillasfri T / L-engineering.
Introduction
Sener og leddbånd (T/L) er viktige komponenter i muskel- og skjelettsystemet som gir viktig støtte og stabilitet til kroppen. Til tross for deres kritiske rolle, er disse bindevevene utsatt for degenerasjon og skade, noe som forårsaker smerte og nedsatt mobilitet1. Videre kan deres begrensede blodtilførsel og langsomme helbredende kapasitet føre til kroniske skader, mens faktorer som aldring, repeterende bevegelse og feil rehabilitering ytterligere øker risikoen for degenerasjon og skade2. Konvensjonelle behandlinger, som hvile, fysioterapi og kirurgiske inngrep, er ikke i stand til å gjenopprette T / L-strukturen og funksjonen fullt ut. I løpet av de siste årene har forskere forsøkt å bedre forstå den intrikate naturen til T / L for å søke effektive behandlinger for T / L-lidelser 3,4,5. T/L kjennetegnes av en hierarkisk organisert, ekstracellulær matrise (ECM)-dominert struktur, hovedsakelig sammensatt av type I kollagenfibre og proteoglykaner, en egenskap som er vanskelig å replikere in vitro6. Tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturmodeller klarer ikke å fange den karakteristiske tredimensjonale (3D) organisasjonen av T / L-vev, noe som begrenser deres translasjonspotensial, samt hindrer den innovative fremgangen innen T / L-regenerering.
Nylig har utviklingen av 3D-organoidmodeller gitt nye muligheter for å fremme grunnforskning og stillasfri vevsteknikk av ulike vevstyper 7,8,9,10,11,12,13. For eksempel, for å undersøke myotendinøs kryss, utviklet Larkin et al. 2006 3D-skjelettmuskelkonstruksjoner sammen med selvorganiserte senesegmenter avledet fra rottehalesene10. Videre regisserte Schiele et al. 2013, ved å bruke mikromaskinerte fibronektinbelagte vekstkanaler, selvmontering av humane dermale fibroblaster for å danne cellulære fibre uten hjelp av 3D-stillas, en tilnærming som kan fange viktige trekk ved embryonal seneutvikling11. I studien av Florida et al. 2016 ble benmargsstromale celler først utvidet til bein- og ligamentlinjer, deretter brukt til å generere selvmonterte monolagscelleark, som deretter ble implementert for å lage en multifasisk bein-ligament-beinkonstruksjon som etterligner det innfødte fremre korsbåndet, en modell som tar sikte på forbedret forståelse av ligamentregenerering12. For å belyse senemekanotransduksjonsprosesser benyttet Mubyana et al. 2018 en stillasfri metodikk der enkeltsenefibre ble opprettet og utsatt for mekanisk belastningsprotokoll13. Organoider er selvorganiserte 3D-strukturer som etterligner den opprinnelige arkitekturen, mikromiljøet og funksjonaliteten til vev. 3D organoidkulturer gir en mer fysiologisk relevant modell for å studere vevs- og organbiologi samt patofysiologi. Slike modeller kan også brukes til å indusere vevsspesifikk differensiering av forskjellige stam-/stamcelletyper14,15. Derfor blir implementering av 3D-organoidmodeller innen T / L-biologi og vevsteknikk en veldig attraktiv tilnærming 9,16. Alternative cellekilder kan implementeres for organoidforsamlingen og stimuleres mot tenogen differensiering. En relevant celletype som brukes til demonstrasjon i denne studien er dermale fibroblaster 7,17,18. Disse cellene er lett tilgjengelige gjennom en hudbiopsiprosedyre, som er mindre invasiv sammenlignet med benmargpunktering eller fettsuging og kan multipliseres ganske raskt til store mengder på grunn av deres gode proliferative kapasitet. I motsetning til dette er mer spesialiserte celletyper, som T / L-residente fibroblaster, mer utfordrende å isolere og utvide. Derfor ble dermal fibroblaster også brukt som utgangspunkt for celleomprogrammeringsteknologier mot induserte pluripotente embryonale stamceller19. Å utsette dermale fibroblaster for spesifikke 3D-kulturforhold og signalsignaler, for eksempel transformerende vekstfaktor-beta 3 (TGFß3), som har blitt rapportert å fungere som en nøkkelregulator for forskjellige cellulære prosesser, inkludert dannelse og vedlikehold av T / L, kan potensere deres in vitro tenogene differensiering som fører til ekspresjon av senespesifikke gener og avsetning av T / L-typisk ECM20, 21.
Her beskriver og demonstrerer vi en tidligere etablert og implementert 3-trinns (2D-utvidelse, 2D-stimulering og 3D-modning) organoidprotokoll ved bruk av kommersielt tilgjengelige normale voksne humane dermal fibroblaster (NHDF) som cellekilde, og tilbyr en verdifull modell for å studere in vitro tenogenese7. Til tross for at denne modellen ikke er ekvivalent med in vivo T/L-vev, gir den fortsatt et mer fysiologisk relevant system som kan brukes til å undersøke cellulære differensieringsmekanismer, etterligne T/L-patofysiologi in vitro og etablere T/L-persontilpasset medisin og legemiddelscreeningsplattformer. Videre kan studier i fremtiden evaluere om 3D-organoidene er egnet for stillasfri T / L-prosjektering ved ytterligere optimalisering, samt brukbar for utvikling av oppskalerte mekanisk robuste konstruksjoner som ligner dimensjonene og strukturelle og biofysiske egenskapene til innfødte T / L-vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultatene demonstrert i denne studien gir verdifull innsikt i etablering og karakterisering av NHDF 3D organoidmodell for å studere T / L-vev. 3-trinns protokollen førte til dannelsen av 3D-stavlignende organoider som viser typiske trekk ved T / L-nisje. Denne modellen er tidligere omtalt i Kroner-Weigl et al. 20237 og demonstrert i detalj her.
Fasekontrastbildene presentert i figur 2 viste progresjonen av NHDF-konfluens og ark…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. og S.M.-D. “CellWiTaL: Reproduserbare cellesystemer for legemiddelforskning – overføring av lagfri laserutskrift av svært spesifikke enkeltceller i tredimensjonale cellulære strukturer” Forslag nr. 13N15874. D.D. og V.R.A. anerkjenner EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistisk opplæring av neste generasjons slitasjegiktforskning” GA Nr. 101034412. Alle forfattere anerkjenner fru Beate Geyer for teknisk assistanse.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
