Demonstração de Cultura de Folha de Células Auto-Montadas e Geração Manual de um Organoide 3D Semelhante a Tendão/Ligamento usando Fibroblastos Dérmicos Humanos
Summary
Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.
Abstract
Tendões e ligamentos (T/L) são estruturas fortes e hierarquicamente organizadas que unem o sistema musculoesquelético. Esses tecidos têm uma matriz extracelular (MEC) rica em colágeno tipo I estritamente disposta e células da linhagem T/L posicionadas principalmente em fileiras paralelas. Após a lesão, o T/L requer muito tempo para reabilitação com alto risco de falha e resultados de reparo muitas vezes insatisfatórios. Apesar dos recentes avanços na pesquisa em biologia T/L, um dos desafios remanescentes é que o campo T/L ainda carece de um protocolo de diferenciação padronizado que seja capaz de recapitular o processo de formação T/L in vitro. Por exemplo, a diferenciação óssea e gordurosa de células precursoras mesenquimais requer apenas cultura de células bidimensionais (2D) padrão e a adição de meios de estimulação específicos. Para diferenciação em cartilagem, é necessária cultura tridimensional (3D) de pellets e suplementação de TGFß. No entanto, a diferenciação celular para o tendão precisa de um modelo de cultura 3D muito ordenado, que idealmente também deve ser submetido a estimulação mecânica dinâmica. Estabelecemos um modelo organoide de 3 etapas (expansão, estimulação e maturação) para formar uma estrutura 3D semelhante a uma haste a partir de uma folha de células automontada, que fornece um microambiente natural com seus próprios fatores ECM, autócrinos e parácrinos. Esses organoides em forma de bastonete têm uma arquitetura celular de várias camadas dentro de um ECM rico e podem ser manuseados com bastante facilidade para exposição a tensão mecânica estática. Aqui, demonstramos o protocolo de 3 etapas usando fibroblastos dérmicos disponíveis comercialmente. Pudemos mostrar que esse tipo de célula forma organoides robustos e abundantes em MEC. O procedimento descrito pode ser ainda mais otimizado em termos de meios de cultura e otimizado para estimulação mecânica axial dinâmica. Da mesma forma, fontes celulares alternativas podem ser testadas quanto ao seu potencial para formar organoides T/L e, assim, sofrer diferenciação T/L. Em suma, a abordagem organoide 3D T/L estabelecida pode ser usada como modelo para pesquisa básica de tendões e até mesmo para engenharia T/L sem andaimes.
Introduction
Tendões e ligamentos (T/L) são componentes vitais do sistema músculo-esquelético que fornecem suporte e estabilidade essenciais ao corpo. Apesar de seu papel crítico, esses tecidos conjuntivos são propensos à degeneração e lesão, causando dor e comprometimento da mobilidade1. Além disso, seu suprimento sanguíneo limitado e capacidade de cicatrização lenta podem levar a lesões crônicas, enquanto fatores como envelhecimento, movimentos repetitivos e reabilitação inadequada aumentam ainda mais o risco de degeneração e lesões2. Os tratamentos convencionais, como repouso, fisioterapia e intervenções cirúrgicas, são incapazes de restaurar totalmente a estrutura e a função T/L. Nos últimos anos, os pesquisadores têm se esforçado para entender melhor a natureza intrincada da T/L, a fim de buscar tratamentos eficazes para os distúrbios T/L 3,4,5. Os T/L distinguem-se por uma estrutura hierarquicamente organizada, dominada pela matriz extracelular (MEC), composta principalmente por fibras colágenas do tipo I e proteoglicanos, característica difícil de ser replicada in vitro6. Os modelos tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) não conseguem capturar a organização tridimensional (3D) característica dos tecidos T/L, limitando seu potencial translacional, bem como dificultando o progresso inovador no campo da regeneração T/L.
Recentemente, o desenvolvimento de modelos organoides 3D ofereceu novas possibilidades para o avanço da pesquisa básica e da engenharia de tecidos livres de andaimes de vários tipos de tecidos 7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, para investigar a junção miotendínea, Larkin et al. 2006 desenvolveram construções musculares esqueléticas 3D junto com segmentos tendinosos auto-organizados derivados do tendão da cauda de rato10. Além disso, Schiele et al. 2013, usando canais de crescimento revestidos de fibronectina microusinados, direcionaram a automontagem de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sem a ajuda de andaimes 3D, uma abordagem que pode capturar características-chave do desenvolvimento do tendão embrionário11. No estudo de Florida et al. 2016, as células estromais da medula óssea foram primeiro expandidas em linhagens ósseas e ligamentares, em seguida usadas para gerar folhas de células de monocamada automontadas, que foram então implementadas para criar uma construção óssea-ligamento-osso multifásica imitando o ligamento cruzado anterior nativo, um modelo que visa melhorar a compreensão da regeneração ligamentar12. Para elucidar os processos de mecanotransdução do tendão, Mubyana et al. 2018 utilizaram uma metodologia sem andaimes pela qual fibras de tendão único foram criadas e submetidas ao protocolo de carregamento mecânico13. Organoides são estruturas 3D auto-organizadas que imitam a arquitetura nativa, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos. As culturas organoides 3D fornecem um modelo fisiologicamente mais relevante para o estudo da biologia de tecidos e órgãos, bem como da fisiopatologia. Tais modelos também podem ser usados para induzir a diferenciação específica do tecido de diferentes tipos de células-tronco / progenitoras14,15. Assim, a implementação de modelos organoides 3D no campo da biologia T/L e engenharia de tecidos torna-se uma abordagem muito atraente 9,16. Fontes celulares alternativas podem ser implementadas para a montagem do organoide e estimuladas para a diferenciação tenogênica. Um tipo de célula relevante usado para demonstração neste estudo são os fibroblastos dérmicos 7,17,18. Essas células são facilmente acessíveis por meio de um procedimento de biópsia de pele, que é menos invasivo em comparação com a punção da medula óssea ou lipoaspiração e pode ser multiplicado rapidamente para grandes números devido à sua boa capacidade proliferativa. Em contraste, tipos de células mais especializadas, como fibroblastos residentes em T / L, são mais difíceis de isolar e expandir. Portanto, os fibroblastos dérmicos também foram usados como ponto de partida para tecnologias de reprogramação celular para células-tronco embrionárias pluripotentes induzidas19. A sujeição de fibroblastos dérmicos a condições específicas de cultura 3D e pistas de sinalização, como o fator de crescimento transformador beta 3 (TGFß3), que tem sido relatado como um regulador chave de vários processos celulares, incluindo a formação e manutenção de T/L, pode potencializar sua diferenciação tenogênica in vitro levando à expressão de genes específicos do tendão e à deposição de ECM T/L típica20, 21.
Aqui, descrevemos e demonstramos um protocolo organoide de 3 etapas (expansão 2D, estimulação 2D e maturação 3D) previamente estabelecido e implementado usando fibroblastos dérmicos humanos adultos normais (NHDFs) disponíveis comercialmente como fonte celular, oferecendo um modelo valioso para estudar a tenogênese in vitro 7. Apesar do fato de que este modelo não é equivalente ao tecido T / L in vivo, ele ainda fornece um sistema mais fisiologicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de diferenciação celular, imitando a fisiopatologia T / L in vitro e estabelecendo medicina personalizada T / L e plataformas de triagem de drogas. Além disso, no futuro, os estudos podem avaliar se os organoides 3D são adequados para a engenharia de T/L sem andaimes, otimizando ainda mais, bem como utilizáveis para o desenvolvimento de construções mecanicamente robustas em escala que se assemelham às dimensões e propriedades estruturais e biofísicas dos tecidos T/L nativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os resultados demonstrados neste estudo fornecem informações valiosas sobre o estabelecimento e caracterização do modelo organoide 3D NHDF para o estudo de tecidos T/L. O protocolo de 3 etapas levou à formação de organoides 3D semelhantes a bastonetes que exibem características típicas do nicho T / L. Este modelo foi relatado anteriormente em Kroner-Weigl et al. 20237 e demonstrado em grande detalhe aqui.
As imagens de contraste de fase apresentadas na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DD e SM-D. reconhecer a Concessão BMBF “CellWiTaL: Sistemas celulares reprodutíveis para pesquisa de medicamentos – impressão a laser sem camada de transferência de células únicas altamente específicas em estruturas celulares tridimensionais” Proposta Nr. 13N15874. DD e VRA reconhecem a concessão da UE MSCA-COFUND OTASKILLS “Treinamento holístico de pesquisas de osteoartrite de próxima geração” GA Nr. 101034412. Todos os autores agradecem à Sra. Beate Geyer pela assistência técnica.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
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