Demostración de cultivo de láminas celulares autoensambladas y generación manual de un organoide similar a un tendón/ligamento en 3D mediante el uso de fibroblastos dérmicos humanos
Summary
Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.
Abstract
Los tendones y ligamentos (T/L) son estructuras fuertes y jerárquicamente organizadas que unen el sistema musculoesquelético. Estos tejidos tienen una matriz extracelular (MEC) rica en colágeno tipo I estrictamente dispuesta y células de linaje T / L ubicadas principalmente en filas paralelas. Después de una lesión, las T/L requieren mucho tiempo para la rehabilitación con un alto riesgo de fracaso y, a menudo, resultados de reparación insatisfactorios. A pesar de los recientes avances en la investigación de la biología T/L, uno de los desafíos pendientes es que el campo T/L aún carece de un protocolo de diferenciación estandarizado que sea capaz de recapitular el proceso de formación de T/L in vitro. Por ejemplo, la diferenciación ósea y grasa de las células precursoras mesenquimales requiere solo un cultivo celular bidimensional (2D) estándar y la adición de medios de estimulación específicos. Para la diferenciación al cartílago, es necesario el cultivo tridimensional (3D) de gránulos y la suplementación con TGFß. Sin embargo, la diferenciación celular al tendón necesita un modelo de cultivo 3D muy ordenado, que idealmente también debería ser sometida a estimulación mecánica dinámica. Hemos establecido un modelo de organoide de 3 pasos (expansión, estimulación y maduración) para formar una estructura 3D en forma de bastón a partir de una lámina celular autoensamblada, que proporciona un microambiente natural con sus propios factores ECM, autocrinos y paracrinos. Estos organoides en forma de bastón tienen una arquitectura celular de múltiples capas dentro de una ECM rica y se pueden manejar con bastante facilidad para la exposición a la tensión mecánica estática. Aquí, demostramos el protocolo de 3 pasos mediante el uso de fibroblastos dérmicos disponibles comercialmente. Podríamos demostrar que este tipo de células forma organoides robustos y abundantes en MEC. El procedimiento descrito puede optimizarse aún más en términos de medios de cultivo y optimizarse hacia la estimulación mecánica axial dinámica. De la misma manera, se puede probar el potencial de las fuentes celulares alternativas para formar organoides T/L y, por lo tanto, experimentar una diferenciación T/L. En resumen, el enfoque establecido de organoides T/L en 3D se puede utilizar como modelo para la investigación básica de tendones e incluso para la ingeniería de T/L sin andamios.
Introduction
Los tendones y ligamentos (T/L) son componentes vitales del sistema musculoesquelético que proporcionan soporte y estabilidad esenciales al cuerpo. A pesar de su papel crítico, estos tejidos conectivos son propensos a la degeneración y a las lesiones, causando dolor y deteriorode la movilidad. Además, su suministro limitado de sangre y su lenta capacidad de curación pueden provocar lesiones crónicas, mientras que factores como el envejecimiento, los movimientos repetitivos y la rehabilitación inadecuada aumentan aún más el riesgo de degeneracióny lesiones. Los tratamientos convencionales, como el reposo, la fisioterapia y las intervenciones quirúrgicas, no pueden restaurar completamente la estructura y la función de la T/L. En los últimos años, los investigadores se han esforzado por comprender mejor la naturaleza compleja de la T/L con el fin de buscar tratamientos efectivos para los trastornos de la T/L 3,4,5. Las T/L se distinguen por una estructura jerárquicamente organizada, dominada por la matriz extracelular (MEC), compuesta principalmente por fibras de colágeno tipo I y proteoglicanos, una característica difícil de replicar in vitro6. Los modelos tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) no logran capturar la organización tridimensional (3D) característica de los tejidos T/L, lo que limita su potencial de traducción y obstaculiza el progreso innovador en el campo de la regeneración T/L.
Recientemente, el desarrollo de modelos de organoides en 3D ha ofrecido nuevas posibilidades para avanzar en la investigación básica y la ingeniería de tejidos sin andamios de varios tipos de tejidos 7,8,9,10,11,12,13. Por ejemplo, para investigar la unión miotendinosa, Larkin et al. 2006 desarrollaron construcciones de músculo esquelético en 3D junto con segmentos de tendón autoorganizados derivados del tendón de cola de rata10. Por otra parte, Schiele et al. 2013, mediante el uso de canales de crecimiento recubiertos de fibronectina micromecanizados, dirigieron el autoensamblaje de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sin la ayuda de andamios 3D, un enfoque que puede capturar rasgos clave del desarrollo del tendón embrionario11. En el estudio de Florida et al. 2016, las células estromales de la médula ósea se expandieron primero en linajes de hueso y ligamento, y luego se utilizaron para generar láminas de células monocapa autoensambladas, que luego se implementaron para crear una construcción multifásica hueso-ligamento-hueso que imita el ligamento cruzado anterior nativo, un modelo que tiene como objetivo mejorar la comprensión de la regeneración del ligamento12. Para dilucidar los procesos de mecanotransducción de tendones, Mubyana et al. 2018 utilizaron una metodología sin andamios mediante la cual se crearon fibras de tendones individuales y se sometieron a un protocolo de carga mecánica13. Los organoides son estructuras 3D autoorganizadas que imitan la arquitectura nativa, el microambiente y la funcionalidad de los tejidos. Los cultivos de organoides en 3D proporcionan un modelo fisiológicamente más relevante para estudiar la biología de tejidos y órganos, así como la fisiopatología. Estos modelos también se pueden utilizar para inducir la diferenciación específica del tejido de diferentes tipos de células madre/progenitoras14,15. Por lo tanto, la implementación de modelos de organoides 3D en el campo de la biología T/L y la ingeniería de tejidos se convierte en un enfoque muy atractivo 9,16. Se pueden implementar fuentes celulares alternativas para el ensamblaje de organoides y estimularlas hacia la diferenciación tenogénica. Un tipo de célula relevante utilizado para la demostración en este estudio son los fibroblastos dérmicos 7,17,18. Estas células son fácilmente accesibles a través de un procedimiento de biopsia de piel, que es menos invasivo en comparación con la punción de médula ósea o la liposucción y puede multiplicarse con bastante rapidez a grandes cantidades debido a su buena capacidad proliferativa. Por el contrario, los tipos de células más especializados, como los fibroblastos residentes en T/L, son más difíciles de aislar y expandir. Por lo tanto, los fibroblastos dérmicos también se utilizaron como punto de partida para las tecnologías de reprogramación celular hacia células madre embrionarias pluripotentes inducidas19. El sometimiento de fibroblastos dérmicos a condiciones específicas de cultivo 3D y señales de señalización, como el factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFß3), que se ha informado que actúa como un regulador clave de varios procesos celulares, incluida la formación y el mantenimiento de T/L, puede potenciar su diferenciación tenogénica in vitro, lo que conduce a la expresión de genes específicos del tendón y la deposición de ECM típica de T/L20. Artículo 21.
Aquí, describimos y demostramos un protocolo de organoides de 3 pasos (expansión 2D, estimulación 2D y maduración 3D) previamente establecido e implementado utilizando fibroblastos dérmicos humanos adultos normales (NHDF) disponibles comercialmente como fuente celular, ofreciendo un modelo valioso para estudiar la tenogénesis in vitro 7. A pesar de que este modelo no es equivalente al tejido T/L in vivo, proporciona un sistema fisiológicamente más relevante que puede utilizarse para investigar los mecanismos de diferenciación celular, imitar la fisiopatología T/L in vitro y establecer plataformas de detección de fármacos y medicina personalizada T/L. Además, en el futuro, los estudios pueden evaluar si los organoides 3D son adecuados para la ingeniería de T/L sin andamios mediante una mayor optimización, así como utilizables para el desarrollo de construcciones mecánicamente robustas a escala que se asemejen mucho a las dimensiones y propiedades estructurales y biofísicas de los tejidos T/L nativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados demostrados en este estudio proporcionan información valiosa sobre el establecimiento y la caracterización del modelo de organoide NHDF 3D para el estudio de los tejidos T/L. El protocolo de 3 pasos condujo a la formación de organoides en forma de bastón en 3D que exhiben características típicas del nicho T/L. Este modelo se informó anteriormente en Kroner-Weigl et al. 20237 y se demostró con gran detalle aquí.
Las imágenes de contraste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. y S.M.-D. reconocer la subvención del BMBF “CellWiTaL: Sistemas celulares reproducibles para la investigación de fármacos – impresión láser sin capas de transferencia de células individuales altamente específicas en estructuras celulares tridimensionales” Propuesta Nr. 13N15874. D.D. y V.R.A. reconocen la subvención EU MSCA-COFUND OSTASKILLS “Formación holística de las investigaciones sobre la osteoartritis de próxima generación” GA Nr. 101034412. Todos los autores agradecen a la Sra. Beate Geyer por su asistencia técnica.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
